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ELVEFLOW微流控系统在病原微生物核酸快速提取及其微流控进展
2023-12-4 阅读(476)
细菌、真菌、病毒等病原微生物威胁着人类健康, 全球每年因食品沙门氏菌污染而患病的有数百万人, 机会致病真菌新生隐球菌每年导致数十万人死亡, 病毒造成全球近 700 万人丧生。准确鉴别致病微生物是发现和防治食品安全危害和重大传染病的重要先决条件。目前通用的病原微生物检测方法基于核酸扩增, 食品的基质复杂且种类不一, 如何从食物样本中快速、高效地提取病原微生物核酸是亟需解决的技术挑战, 已成为核酸快速检测的限速环节。微生物核酸通常包裹于坚固的细胞壁内, 细菌细胞壁主要成分是肽聚糖, 革兰氏阴性细菌的细胞壁肽聚糖含量较少(仅 1~2 层), 而革兰氏阳性细菌的细胞壁由厚达 40~80 nm 的多层肽聚糖(15~50 层)组成, 其细胞壁厚度也远高于革兰氏阴性细菌。真菌细胞壁由多糖和蛋白质组成, 主要包括几丁质、葡聚糖和甘露聚糖/半乳甘露聚糖。基于此, 细菌和真菌核酸提取相对困难。病毒是结构简单的非细胞型微生物, 主要由蛋白质外壳和核酸组成。病毒的蛋白质外壳称为核衣壳, 由壳粒组成, 对病毒核酸起保护作用, 且介导病毒核酸侵入宿主细胞。病毒蛋白外壳相对脆弱, 核酸提取过程较为容易。
核酸提取微流控芯片
微流控芯片可在微米、毫米尺度完成分离、转移、萃取、吸附、洗涤等复杂的单元操作, 实现蛋白质和核酸等复杂分子的分离和检测。基于液滴的微流体技术有高通量、并行化、集成化的优势, 已被广泛用于生物检测, 如癌症生物标志物、细胞外分泌物等。为构建适用于现场化的病原微生物检测方法, 微流控芯片的自动化、集成化及高通量过程提供了良好的改进手段, 其设计原理大致如所示。目前, 已有多种核酸提取方法与微流控装置组合使用, 可简化操作过程、减少试剂用量、提高检测效率
微型磁珠微流控芯片
OH 等开发了一种全集成的自动离心微流控装置用于多重食源性病原体检测, 该检测装置使用微型珠子辅助提取 DNA, 提高了样品的处理能力。将磁珠与微芯片相结合对水传播病原体进行 DNA 提取和检测, 该方法第一次使用嵌入式振动装置在 180 Hz 下对芯片上细胞进行裂解, 裂解效率约为 97%。裂解释放后的 DNA 会与壳聚糖涂覆的纳米磁珠结合形成复合物, 再用洗涤液除去细胞碎片和蛋白质等得高纯 DNA, 提取效率接近 100%。与 TRIzol 法相比(2 h), 该系统提取仅需 15 min 且 DNA 质量相近, 并且具有操作简单、耗时短和高灵敏度的优点。GOWDA 等组合磁珠和硅基研磨珠, 将核酸提取过程设置于碟式芯片上, 完成从核酸提取、纯化、扩增的全流程仅需 1 h。利用磁珠法制备的微流控芯片, 其裂解、抽提、纯化、检测等步骤均可集成一体, 具有较大应用空间, 但该过程不易满足高通量检测要求。
超声波微流控芯片
超声波微流控芯片利用表面声波振荡驱动含细胞微滴碰撞芯片表面来破坏细胞膜的原理, 释放细胞内的蛋白质和核酸。ZHANG 等开发了一种可在 1 min 内从血清样品提取 HBV 和 HIV 病毒核酸的微流控芯片, 该芯片配备压力驱动弹性膜阀, 将微流控通道分成多个室(试剂储存室、反应室), 其核心提取部件为超声波细胞裂解和基于二氧化硅膜的固相萃取。该方法效率高, 样品消耗低, 可在医院或生物实验室中预处理少量测试样本。 超声波微流控芯片利用表面声波振荡驱动含细胞微滴碰撞芯片表面来破坏细胞膜的原理, 释放细胞内的蛋白质和核酸。ZHANG 等开发了一种可在 1 min 内从血清样品提取 HBV 和 HIV 病毒核酸的微流控芯片, 该芯片配备压力驱动弹性膜阀, 将微流控通道分成多个室(试剂储存室、反应室), 其核心提取部件为超声波细胞裂解和基于二氧化硅膜的固相萃取。该方法效率高, 样品消耗低, 可在医院或生物实验室中预处理少量测试样本。
总结
虽然分子检测技术飞速发展, 多种核酸扩增技术日益成熟, 但核酸快速提取技术相对落后, 已成为病原微生物现场化检测亟需解决的痛点问题。病原微生物的核酸提取过程, 实质上是将细菌、真菌、病毒的细胞壁、细胞膜或蛋白质外壳破碎, 使其内的核酸释放且收集纯化的过程。本文从病原微生物微观结构着眼, 概述了病原微生物细胞裂解、核酸提取、核酸纯化等全过程大致发展趋势, 总结了快速化提取病原微生物核酸的创新方法及其适用范围。物理裂解法依赖超声波、机械剪切力等相关设备, 且得率相对低, 成本较高; 化学裂解法快速高效, 但对核酸损伤较大, 不利于精确核酸分析; 酶法裂解特异性强, 获取核酸质量和得率高, 但消耗时间较长。固相萃取快速高效、性价比高, 是应用潜力最大的核酸纯化方式之一, 其中纤维素纸基法具有代表性。综上所述, 病原菌核酸快速提取方法未来可能有三大突破方向。第一, 开发高亲和力吸附核酸的新型载体(如凹凸捧土), 综合各种裂解方法的优势, 组合创新成为优质高效方法。本团队融裂解、提取和纯化三过程为一体, 正研发一种集成碱热裂解和固相萃取相结合的快速提取方法, 实现一步法高效核酸提取, 现已完成了相关验证和配套提取装置的研发(待发表)。第二, 根据食品基质的来源或后续核酸扩增方法的不同, 优化设计出针对性核酸提取方法。例如, 植物基质食品采用裂解条件相对剧烈的方法, 而动物性食品采用相对温和的提取方法。PCR 选用核酸纯度较高的方法, 而 LAMP 用粗提核酸即可。第三, 在上述提取方法研究的基础上, 开发更为精巧微流控芯片, 进一步降低试剂消耗, 提升核酸提取的样本通量, 增加提取过程的自动化程度, 未来在病原微生物检测领域中有巨大潜力。
4. 采用微流控制备脂质体纳米粒的优势
脂质体纳米粒LNP的传统制备方法包括沉淀法，乳化法，溶剂蒸发及超声波处理等方法，但是传统制备方法存在粒径分布广和批间重复性差的问题，对药物开发的临床试验和生产具有很大影响。而微流控技术是作为制备纳米脂质体的因为就具有以下优势而引起人们的极大关注
采用微流控制备脂质体纳米粒的优势包括：
Ø 缩短混合时间
Ø 提高均一性
Ø 单分散性高（PDI低于0.2）
Ø 高通量和连续生产
Ø 纳米颗粒生产的集成和自动化
Ø 通过精确的流速控制，可实现多种粒径的单分散纳米颗粒
Ø 多次制备的重复性好
Ø 使用同一套流量控制系统合成小体积（μL）和大体积（L）的脂质体纳米粒
5、影响脂质体纳米粒合成的因素
大部分纳米脂质体应用都用于抗癌药物，mRNA，siRNA等包封。纳米颗粒的大小决定包封分子数量，并影响LNP 与细胞组织的相互作用及释放动力学，粒径的微小差异都可以引起药物递送效率的极大不同。此外，粒径大小分布也会引起包封和释放效率的不同，因此精确控制纳米脂质体颗粒的大小和具有低的粒径分布是及其重要，微流控技术可以精确控制流体的大小和两相的比例，从而精确控制粒径的大小和分布。
合成脂质体纳米粒非常重要部分是实现有机相和水相的快速混合，混合的效率和均一性越好，获得脂质体纳米粒的大小和分布越精确。
目前常采用两种类型的微流控芯片进行纳米脂质体的合成，一种是鱼骨形芯片，一种是流动聚焦型芯片，这两种芯片可以实现有机相和水相的控制和快速混合，乙醇相的快速稀释可获得小粒径的LNP。
纳米脂质体颗粒的大小不仅取决于所用芯片，而且受脂质体溶液组成（类型，分子量大小，浓度等）和水溶液组成（pH，盐浓度，表面活性剂）以及两相流速比（FRR）及总流速（TFR）的影响。
FRR( flow rate ratio)是指水相流速和有机相流速的比，是制备LNP 重要的参数，依据经验较高的流速比会合成较小的纳米脂质体，尤其采用流动聚焦芯片时，FRR影响更大，而使用人字形芯片是，FRR 影响较小。
TFR（total flow rate）是指水相和有机相和流速之合，当使用流动聚焦芯片是，TFR 影响较小，而使用鱼骨形芯片时，提高TFR会降低混合时间，从而使得LNP颗粒变小。
有机相中脂类的组成及脂类的浓度也是觉得脂质体颗粒大小的重要因素，一般情况下，高的脂类浓度会合成较小的LNP。其他影响因素还包括pH值，温度，缓冲液组成等。
6、脂质体纳米粒合成系统组成
脂质体纳米粒合成系统需要流量控制系统和微流控芯片，具体包括2通道的OB1 压力驱动的流量控制器，2个流量传感器，2个储液管以及微流控芯片。采用鱼骨形微流控芯片和流动聚焦微流控芯片的具体连接如下图：
此脂质体纳米粒合成系统的原理是，连接至压力源的压力控制器提供一个稳定的压力数值，通过管线为密封储液管施加固定的压力，从而将储液管中的液体稳定的输出，并经过流量传感器，流量传感器测定流量并反馈给压力控制器，从而达到精确流量控制的目的，随后流体被稳定、精确的输送到微流控芯片中，具体参数可通过电脑上的软件进行控制设定。2通道的压力控制器分别控制含脂质的乙醇相和水相溶液，两相溶液可以分别调节流速，经过流量传感器和阻尼器后在微流控芯片中混合，从而合成纳米脂质体，具体可以通过调节乙醇相及水相的流速，流速比及总流速，获得固定粒径大小的纳米脂质体
与注射泵相比，此系统中的压力驱动控制器具有压力稳定性好，流量精确度高，无脉动，稳定时间短，相应速度快等优点，是微流控系统中性能最佳的流量控制器，是制备纳米脂质体颗粒的理想用泵。
此微流控系统是专为研究者设计的脂质体纳米粒合成系统，即便没有微流控和纳米脂质体合成经验的研究者可以轻松合成纳米脂质体。依据简单直观的操作指南可以精确控制纳米脂质体合成的参数，以100ul/min-30ml/min流速连续合成脂质体，可获得60-250nm高分散性的纳米颗粒。此系统可以根据客户需求合成脂质体和固体脂质体粒以及其他类型的纳米颗粒。
