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上海博湖生物科技有限公司
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免疫荧光实验背景染色较深的原因
2022-6-10 阅读(5021)
背景染色较深的原因有哪些?
1、抗体浓度过高一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化找到适合自己实验室的理想工作浓度既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。
2、抗体孵音时间过长或温度较高解决办法是严格执行操作规程更好随身佩带报时表或报时钟及时提醒避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法(Polymer)敏感性很高要求一抗孵育的时间不是传统的1小时而是30分钟因此要根据染色结果进行调整。
3、DAB变质和显色时间太长DAB更好现用现配如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长因为在没有酶的情况下过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色更好在显微镜下监控达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时这样做似乎不现实但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控避免显色时间过长。
4、组织变干修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细采用DAKO笔或PAPPen在组织周围画圈可以有效的避免液体流失也能提高操作速度。
5、切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长(大于24小时)原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前将切片脱蜡至修复第二天加抗体进行免疫组化染色如果将装有切片和修复液的容器放在40C冰箱过夜对结果无明显影响如果放在室温特别是炎热的夏天会出现背景着色因此，不可存放时间太长。
6、一抗变质、质量差的多克降抗体注意抗体的有效期过期的抗体要么不昂色要么背暑着色，用新买抗体时更好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较
