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上海博湖生物科技有限公司
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PCR反应体系各个组份优化
2024-3-4 阅读(94)
PCR 反应体系由反应缓冲液（10×PCR Buffer）、脱氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、耐热 DNA 聚合酶（Taq 酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA 模板）五部分组成。各个组份都能影响 PCR 结果的好坏。PCR反应需要一定的条件才能完成，这些条件主要有以下方面：
一、缓冲液
任何一个生化反应都必须在一定的缓冲体系中进行，缓冲体系除了提供一定的pH缓冲能力外，还有一些有助于反应进行的成分。PCR反应缓冲液通常采用10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.3-9.0，室温）缓冲液体系，其中含有可激活DNA聚合酶的活性中心的二价阳离子，一般采用Mg2+，以MgCl2的形式提供，Mg2+的浓度高低可显著影响 PCR扩增产物的特异性，此外，缓冲液中还含有50 mmol/L的K+，有利于引物与模板的退火。有些缓冲液中还加入明胶或血清白蛋白（100 μg/mL）及去污剂（如Twcen20 等），对Taq DNA聚合酶起稳定作用。
二、模板
PCR模板是含有待扩增序列的 DNA、mRNA或cDNA等，模板数量可直接影响扩增的效果。对于一般的 PCR扩增，104～107个模板分子可达到满意的效果，一般宜用纳克（ng）级的克隆DNA、微克（μg）水平的染色体DNA或102～105拷贝待扩增的DNA片段作为起始材料。除了数量外，模板的质量也非常重要，不能有太多的蛋白质和其他污染，特别是其他DNA的污染，即使是痕量的DNA，也会导致非特异性产物。
三、dNTP
dNTP是dATP、dTTP、dGTP、dCTP的总称。贮备液为pH 7.0 左右，其浓度一般为20 mmol，-20℃保存。体系中为20~200 μmol即可，过低则反应速度下降，浓度过高则特异性下降，因为dNTP能络合溶液中的Mg2+，产生错配或抑制Taq DNA聚合酶活性。
四、耐热的DNA聚合酶
PCR反应中使用的 DNA聚合酶必须耐高温，在90℃以上的高温下仍能有活性，正是由于耐热DNA聚合酶的应用才使 PCR技术得以实现，目前使用的耐高温DNA聚合酶主要有Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶和Pwo DNA聚合酶等。
五、引物
PCR反应的最佳条件根据大量的研究报道，PCR反应的最佳条件为：①Taq DNA聚合酶的浓度为1.0-2.5 U/100μL反应液；②dNTP的浓度为20～200 μmol/L；③Mg2+浓度为0.5～2.5 mmol/L；④引物的浓度为0.2～1.0 μmol/L。在准备具体的PCR反应时，还要针对模板特性、PCR仪等进行上述反应体系的优化，并设置试验确定连退火温度、延伸时间，建立其相应的PCR反应优程序。
