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上海博湖生物科技有限公司
主营产品： 高密度脂蛋白ELISA检测试剂盒,同型半胱氨酸ELISA检测试剂盒,游离脂肪酸ELISA检测试剂盒 |
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蛋白浓度测定过程
2024-7-15 阅读(350)
取适量未变性的总蛋白溶液，用 BCA 蛋白定量检测试剂盒(G2026-200T；G2026-1000T)测蛋白浓度，蛋白浓度测定过程如下：
1.配制蛋白标准贮备液
取1 mL蛋白标准配制液加入到蛋白标准品(BSA)蛋白标准管中，将25 mg蛋白标准品全溶解，即得到浓度为25 mg/mL的蛋白标准贮备液。配制成的蛋白标准溶液可-20℃长期保存。
2.配制蛋白标准工作液
取适量25 mg/mL蛋白标准贮备液，用PBS或生理盐水稀释50倍，得到终浓度为0.5 mg/mL的蛋白标准工作液。注意稀释时按照10倍梯度方法稀释，确保稀释准确。
3.绘制标准曲线（酶标仪法）
将蛋白标准工作液分别按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板中，然后用PBS或生理盐水依次加20、19、18、16、12、8、4、0 μL将上述梯度工作液补足到20 μL。得到蛋白浓度依次为0、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL的梯度曲线。
4.准备待测样品
将待测的蛋白样品进行适当稀释(可通过预实验检测，使样品蛋白浓度在标准曲线范围内，确保检测结果可信)，按照每个样品20 μL的量加到96孔板中。待测样品与蛋白标准品用相同溶液稀释。
5.配制BCA显色工作液
将BCA试剂与硫酸铜溶液按照50:1体积比充分混合均匀，得到BCA显色工作液。BCA显色工作液可室温保存，24 h内使用。每个待测样品需200 μL，建议按需配制，避免浪费。
6.检测
向标准曲线样品孔及待测样品孔中每孔加入BCA显色工作液200 μL，充分混匀(可将96孔板放在振荡器上振荡30 s)，37℃反应30 min后，以标准曲线0号做参比，在562 nm波长下比色测定，记录各孔吸光度值。(注：也可以在室温反应2 h，或60℃反应30 min。如果蛋白浓度较低，建议置于60℃反应)
7.计算
以标准曲线中梯度蛋白含量(μg/mL)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应孔中待测样品的蛋白浓度(μg/mL)，再乘以样品稀释倍数即为待测样品实际蛋白浓度。
