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上海博湖生物科技有限公司
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逆转录（RT-PCR）实验要素介绍
2024-8-5 阅读(409)
逆转录（reverse transcription）实验作为是常见的分子生物学实验之一，逆转录是以 RNA 为模板合成 DNA 的过程，即 RNA 指导下的 DNA 合成，逆转录实验包括3大要素，分别是引物、逆转录酶和 RNA 模板：
1. 引物：逆转录引物主要有3种，包括 Oligo(dT)、Random Primers 和基因特异性引物(GSP)。其中 Oligo(dT)具有12-20个 T 碱基，并且与真核生物 mRNA 的 3’Poly A 尾配对，可合成全长的 cDNA，但仅扩增有 polyA 尾的 mRNA ，对模板质量要求高，较适合克隆实验。而 Random Primers 具有6-9个碱基，可随机识别模板并结合，适合复杂结构和微量模板，但特异性低，小片段多，适合后续 qPCR 实验。基因特异性引物可以识别特定模板序列，具有特异性强，灵敏度高的特点，但需合成特定的序列。所以根据不同实验需求可进行相应引物的选择。
2. 逆转录酶：一种是来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒(AMV)，由两条肽链组成，具有聚合酶活性和很强的 RNaseH 活性，它最适温度是42℃，最适 pH8.3，在高反应温度时可消除 mRNA 的二级结构对逆转录的阻碍，然而高水平的 RNaseH 的活性既抑制 cDNA 产生也限制其长度。另一种来源于鼠白血病病毒(M-MLV)，是单肽链的，有 RNA 聚合酶活性和相对较弱的 RNaseH 活性，最适温度37℃，最适 pH7.6，较弱的 RNaseH 活性对获得2-3kb的 mRNA 的全长 cDNA 有很大好处。
3. RNA 模板：通常利用紫外分光光度计检测纯度，要求A260/280=1.9~2.1，A260/230=2.0~2.2。利用琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整度，完整的总 RNA 在进行琼脂糖凝胶电泳时会产生清晰的28S 和18S rRNA 条带(真核样品)，28S rRNA 条带的强度应当大致为18S rRNA 条带的两倍，并且无 gDNA 和蛋白残留。
