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上海博湖生物科技有限公司
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PCR反应引物设计和选择目的DNA序列区域指南
2024-9-18 阅读(297)
PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：
1、引物长度约为16-30 bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。
2、引物中G+C含量通常为40%-60%，可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm=4(G+C)+2(A+T)。
3、四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C，因这样易导致错误引发。
4、引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应， 以减少由于密码子摆动产生的不配对。
5、在引物内， 尤其在3'端应不存在二级结构。
6、两引物之间尤其在3'端不能互补， 以防出现引物二聚体， 减少产量。两引物间最好不存在 4个连续碱基的同源性或互补性。
7、引物5'端对扩增特异性影响不大， 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物su、荧光素等。通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。
8、引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构， 以免产生非特异性扩增，影响产量。
9、简并引物应选用简并程度低的密码子， 例如选用只有一种密码子的Met， 3'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。
10、一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0 μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体， 过低则降低产量。利用紫外分光光度计， 可精确计算引物浓度， 在1cm光程比色杯中，260nm下，引物浓度可按下式计算：
X mol/L= OD260/A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)
X： 引物摩尔浓度，A、C、G、T：引物中4种不同碱基个数。
