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上海博湖生物科技有限公司
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ELISA实验包验被抗原与包被细胞步骤
2024-10-14 阅读(332)
酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，简写ELISA）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。
一、包被抗原
1. 用 50mM 的碳酸盐包被缓冲液(pH 9.6)溶解抗原，使抗原浓度为 10-20 μg/ ml， 加 100 μl/孔到 96 孔酶标板， 4 oC 放置过夜。
2. 第二天弃去包被液后， 用 PBST 洗涤 3 次，每孔加入 150 μl 1% BSA 37 oC封闭 1 小时。
3. PBST 洗涤 3 次后，每孔加入 100 μl 不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品， 37 oC 孵育 2 小时。
4. PBST 洗涤 5 次后，加入 100μl 稀释后的 HRP 标记的二抗，37 oC 孵育 1 小时。
5. PBST 洗涤 5 次后，显色剂显色 20min 后，酶标仪上读取 A405 吸收值。
二、包被细胞
1. 在 96 孔培养板上接种细胞数为 1 x 104 cells/well ，37℃过夜培养。
2. 第二天用 PBS 洗涤培养板 2-3 次。
3. 加入 125 µl/well 10% Formalin(1:10 稀释) , 室温下固定 15 min。
4. 用 ddH2O 洗涤培养板 3 次，并晾干，储藏在 2-8oC 备用。
5. 用 PBST 洗涤 3 次，每孔加入 150 μl 1% BSA 37 oC 封闭 1 小时。
6. PBST 洗涤 3 次后，每孔加入 100 μl 不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品， 37 oC 孵育 2 小时。
7. PBST 洗涤 5 次后， 加入 100 μl 稀释后的 HRP 标记的二抗,37 oC 孵育 1 小时。
8. PBST 洗涤 5 次后，显色剂显色 20min 后，酶标仪上读取 A405 吸收值。
50mM 的碳酸盐包被缓冲液： 0.05mol/L pH9.6 碳酸缓冲液,4℃,保存, Na2CO3 0.15 克, NaHCO3 0.293 克,蒸馏水稀释至 100 ml。
ABTS 作为底物进行显色反应(10ml)：
1)、0.2M Na2HPO4 2.4ml
2)、0.1M 柠檬酸 2.6ml
3)、ddH2O 5ml
4)、ABTS 5mg
5)、H2O2(30%) 4 ul(用前加入)
注 意：
1、一般做倍比稀释进行检测，需要有相应的对照血清。
2、不同的显色系统对应不同的光吸收值。
