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上海博湖生物科技有限公司
主营产品： 高密度脂蛋白ELISA检测试剂盒,同型半胱氨酸ELISA检测试剂盒,游离脂肪酸ELISA检测试剂盒 |
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人血管紧张素Ⅱ受体抗体elisa试剂盒实验前准备和操作步骤以及注意事项
2018-11-22 阅读(358)
| 提 供 商 | 上海博湖生物科技有限公司 | 资料大小 | 20KB |
|---|---|---|---|
| 资料图片 | 【点击查看】 | 下载次数 | 26次 |
| 资料类型 | WORD 文档 | 浏览次数 | 358次 |
试剂准备
1.使用前将所有的试剂和标本缓慢均衡至室温 （18-25℃），试剂不能直接在 37℃ 溶解。
2.标准品 （冻干品）：每瓶标准品加入标准品稀释液 1 mL，盖好后室温静置大约 10 分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为 1000pg/mL。准备 7 个稀释标准品的 EP 管，每个 EP 管中加入 500μL 的标准品稀释液，如图所示依次倍比稀释成 1000pg/mL，500pg/mL，250pg/mL，125pg/mL，62.5pg/mL，31.2pg/mL，15.6pg/mL，标准品稀释液 （0pg/mL） 直接作为空白孔。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
3.检测溶液 A 及检测溶液 B：Detection A 及 Detection B 在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。临用前分别以检测稀释液 A 或 B1:100 稀释 （如：10μL 检测溶液 A/990μL 检测稀释液 A），充分混匀，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制 （100μL/孔），实际配制时应多配制 0.1-0.2 mL。
4.浓洗涤液：用 580 mL 蒸馏水或去离子水将 20 mL 浓洗涤液稀释至 600 mL，进行 30 倍稀释。
5.底物溶液：请用灭菌的移液器吸头吸取所需体积的 TMB 至另一干净容器中使用，容器中剩余的底物应予丢弃，不要倒回 TMB 瓶中。
注意：
1、 标准品的稀释不能直接在板中进行。
2、 标准品请于临用前 15 分钟内配制。该标准品只能使用一次。
3、 标准品、检测溶液 A 工作液、检测溶液 B 工作液请使用相应的稀释液配制，不能混淆。混匀时要轻轻充分混匀，避免起泡。为保证实验结果的准确请使用微量吸管，并校准微量加液器。请依据所需的量配制，尽量不要微量配制 （如吸取检测溶液 A 时，一次不要小于 10μL），以避免造成浓度误差。
4、 请勿重复使用已经稀释过的标准品、检测溶液 A 工作液和检测溶液 B 工作液。
5、 浓洗涤液中如有结晶析出，请先温育至室温，轻轻混匀，至到结晶*溶解再进行配制。
6、 试剂盒中部分试剂为储存液，客户需配置成工作液后使用，在配置过程中如因纯净水质量差或水质污染，以及实验中所用耗材洁净度差，可能造成实验结果不准
操作步骤
1.加样：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔 7 孔，依次加入 100μL 不同浓度的标准品 （见试剂准备 2）。空白孔加 100μL（见试剂准备第二步*后一管），余孔加待测样品 100μL，酶标板加上覆膜，37℃ 温育 2 小时。
2.弃去液体，甩干，不用洗涤。
3.每孔加检测溶液 A 工作液 100μL（临用前配制），酶标板加上覆膜，37℃ 温育 1 小时。
4.弃去孔内液体，每孔用 300μL 的洗涤液洗涤，浸泡 1-2 分钟，吸去 （不可触及板壁） 或甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次 （也可轻拍将孔内液体拍干），重复洗板 3 次。*后一次洗涤后，要把孔内的洗涤液*甩干。自动洗板机亦可。
5.每孔加检测溶液 B 工作液 （临用前配制）100μL，加上覆膜，37℃ 温育 1 小时。
6.弃去孔内液体，甩干，洗板 5 次，方法同步骤 4。
7.每孔加底物溶液 90μL，酶标板加上覆膜，37℃ 避光显色 （反应时间控制在 15-25 分钟，不要超过 30 分钟。当标准孔的前 3-4 孔有明显的梯度蓝色，后 3-4 孔梯度不明显时，即可终止）。
8.每孔加终止溶液 50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不匀一，请轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀。
9.在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在 450nm 波长测量各孔的光密度 （O.D. 值）。
注意：
1.试剂准备：准备一次实验所需要的酶标条，其它的可从微孔板上拆下，密封，按照说明书要求保存，以备下次使用。
2.加样：实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。加样时注意不要有气泡，将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。加样或加试剂时，个孔与*后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的「预温育」时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。因此，一次加样时间 （包括标准品及所有样品） 控制在 10 分钟内。设置复孔进行实验。
3.温育：为防止样品蒸发，实验时请将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内，以避免液体蒸发，洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态，同时应严格遵守给定的温育时间和温度。
4.洗涤：充分的洗涤非常重要，在每次洗涤过程中，都要将洗涤液*甩干。洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响*后的酶标仪读数。如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实 验过程中。
5.反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化 （比如，每隔 10 分钟观察一次），如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。
6.底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。
7.如果实验室内湿度低于 60%，使用加湿器提高湿度水平。
