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公司信息
致泻性大肠埃希氏菌五重 PCR 试剂盒
2020-12-25 阅读(788)
产品名称：致泻性大肠埃希氏菌五重 PCR 试剂盒产品规格：50T/盒
产品货号：KLP08-A0231
产品简介：
大肠埃希氏菌是一类能引起人体以腹泻症状为主的病原菌，常见的致泻大肠埃希氏菌主要包括肠道集聚 性 大 肠 埃 希 氏 菌（ enteroaggregative Escherichia coli, EAEC ）、 肠 道 致 病 性 大 肠 埃 希 氏 菌（enteropathogenic Escherichia coli， EPEC）、产志贺毒素大肠埃希氏菌(shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC) (包括肠道出血性大肠埃希氏菌（enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）)、产肠毒素大肠埃希氏菌（enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）、肠道侵袭性大肠埃希氏菌（enteroinvasive Escherichia coli, EIEC）。该菌广泛存在于自然界，当其污染食品或水源后，可引起细菌性食物中毒或水源性腹泻病爆发流行，所以致泻大肠埃希氏菌的检测对社会卫生健康具有极大的意义。
为了满足致泻大肠埃希氏菌检测及研究的需要，本公司根据标准 GB4789. 6 合成了致泻大肠埃希氏菌特征性基因特异性引物，并优化形成本试剂盒。应用本试剂盒进行检测具有快速、灵敏、特异、准确、操作简单等特点及优点。
包装规格及成分：
编号 | 成分 | 规格 |
试剂一 | 致泻大肠埃希氏菌五重 PCR 反应液 | 1 mL×1 管 |
试剂二 | 阳性对照 | 200 µL×1 管 |
试剂三 | 阴性对照 | 200 µL×1 管 |
使用说明书 | 1 份 | |
运输及保存：低温运输，-20℃保存。操作步骤：
一、样本制备（参考 GB4789. 6）
固态或半固态样品：固体或半固态样品,以无菌操作称取检样 25 g，加入装有 225 mL 营养肉汤的均质杯中，用旋转刀片式均质器以 8000 r/min~10000 r/min 均质 1 min~2 min，或加入装有 225 mL 营养肉汤的均质袋中，用拍击式均质器均质 1 min~2
min 。
液态样品：以无菌操作量取检样 25 mL，加入装有 225 mL 营养肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)，振荡混匀。
二、增菌
将 1 制备的样品匀液于 36℃±1℃ 培养 6 h，取 10 μL ,接种于 30 mL 肠道菌增菌肉汤管内，于 42℃±1℃培养 18 h 。
三、分离
将增菌液划线接种 MAC 和 EMB 琼脂平板，于 36 ℃±1 ℃ 培养 18 h~24 h ,观察菌落特征。在 MAC 琼脂平板上，分解乳糖的典型菌落为砖红色至桃红色，不分解乳糖的菌落为无色或淡粉色；在 EMB 琼脂平板上，分解乳糖的典型菌落为中心紫黑色带或不带金属光泽，不分解乳糖的菌落为无色或淡粉色，应挑取乳糖发酵，以及乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。
四、PCR 模板制备
- DNA 提取:使用 1 μL 接种环刮取营养琼脂平板或斜面上培养 18 h~24 h 的菌落悬浮在 200 μL 0. 85%灭菌生理盐水中，充分打散制成菌悬液，于 13000r / min 离心 3min，弃掉上清液。加入 1 mL 灭菌去离子水充分混匀菌体，于 100℃水浴或者金属浴维持 10 min；冰浴冷却后 13000 r / min 离心 3 min，收集上清液；按 1∶ 20 的比例用灭菌去离子水稀释上清液，取 5 μL 作为 PCR 检测的模板；可用细菌基因组提取试剂盒提取细菌 DNA，操作方法按照细菌基因组提取试剂盒说明书进行。
- DNA 保存:所有处理后的 DNA 模板直接用于 PCR 反应或暂存于 4 ℃ 并当天进行PCR 反应；否则，应在-20 ℃ 以下保存备用 1 周。也可用细菌基因组提取试剂盒提取细菌 DNA，操作方法按照细菌基因组提取试剂盒说明书进行。
五、试剂准备
- 扩增试剂准备（在反应混合液配制区进行）：从试剂盒中取出 PCR 反应液，解冻混匀，瞬离后向每个 PCR 管中各分装 20 μL PCR 反应液，转移至样本处理区。
- 加样（在样本处理区进行）：在 PCR 反应管内加入 5 μL 制备的核酸样本阳性对照或阴性对照，盖上盖子，轻弹混匀并瞬时离心后，立即转移至检测区进行反应。总反应体系如下表。
试剂 | 添加量（25 μL） |
致泻大肠埃希氏菌五重 PCR 反应液 | 20 μL |
DNA 样品/阳性对照/阴性对照 | 5 μL |
六、PCR 检测（在检测区进行） 请按照下表设置反应程序：
阶段 | 温度设计 | 循环数 | ||
预变性 | 98℃ | 30 | sec | 1 × |
PCR 反 应 | 98℃ | 15 | sec |
30 × |
55℃ | 30 | sec | ||
68℃ | 10 | sec | ||
反应结束后，将产物进行 1.8%琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后分析其条带情况。 | ||||
【结果判定方法】结果判定
1) 阴性对照：无目的基因条带
2) 阳性对照：有目的基因 Stx1（244 bp）和 sth（171 bp）的明显条带。
致泻大肠埃希氏菌类别 | 阳性基因名称 | 片段长度（bp） |
肠道聚集性大肠埃希氏菌（EAEC） | astA | 102 |
肠道致病性大肠埃希氏菌（EPEC） | escV | 544 |
产志贺毒素大肠埃希氏菌/肠道出血性大肠埃希 氏菌 （STEC / EHEC） | Stx1, escV+ Stx1 | 244 / 544+244 |
产肠毒素大肠埃希氏菌（ETEC） | sth | 647 |
肠道侵袭性大肠埃希氏菌（EIEC） | ipaH | 171 |
注意事项
1. 开始检测前请仔细阅读本说明书，按要求操作。
2. 组织样品的样本处理和核酸扩增应注意生物安全
3. 试剂使用前，应充分融化均匀后，瞬时离心；PCR 反应管避免反复冻融。
4. 加样时应使样品落入反应液中，不应有样品黏附于管壁上，加样后应尽快压紧管盖。
5. 经样品前处理液处理过的样本，不能用于样本保存，仅用于即时检测
6. 研磨组织样本不宜过大，以防杂质含量高而抑制后续的 PCR 反应。
7. 样品前处理液可置于 4℃保存。
8. 本产品只能用于科研实验，不能用于临床诊断。
