上海雅吉生物科技有限公司
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更新时间:2019-05-24 15:19:16浏览次数:108
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交链孢霉属通用染料法荧光定量PCR试剂盒实验方法原理 多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是一种模拟天然DNA复制过程,在体外扩增特异性DNA(或RNA)片段的新技术。本实验是将待检双链DNA经94℃高温变性成单链作模板,然后加入一对人工合成的寡核苷酸引物,引物分别与待扩增DNA片段的两端互补,经55℃ 低温退火,引物与模板互补结合。在72℃条件下,结合于模板上的引物在DNA聚合酶的催化下,利用反应体系中的4种dNTP为原料,按碱基互补配对的方式延伸合成两条新的DNA链。所扩增的DNA可作为下一轮扩增反应的模板。重复上述循环过程,经过20~30个周期后,特异的目的DNA可扩增百万倍以上。 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后即可观察到特异的扩增条带。
实验材料 血清样品
试剂、试剂盒 HBV-PCR反应液 HBV-DNA裂解液阳性模板溴化乙锭
仪器、耗材 PCR扩增仪电泳仪紫外线分析仪
实验步骤
一、标本处理
取混匀的血清20μl加20μl裂解液,搅匀后100℃沸水浴10分钟,后15000rpm/min离心3分钟,取4μl上清待检。
二、加样及PCR
取反应液一管(使用前稍加离心),加4μl待检上清或阳性对照于底层反应液中,混匀后高速离心片刻,然后置PCR仪,设置程序94℃预变性2分钟,再按94℃/30秒、55℃/30秒、72℃/60秒扩增35个循环。
三、电泳与结果判断
取15μl 反应液,经2%琼脂糖凝胶电泳(5V/cm)30分钟后,在紫外灯下观察结果,若410bp处出现橙黄色带,则HBV为阳性。
收起
交链孢霉属通用染料法荧光定量PCR试剂盒注意事项
1. 反应管中加好所有试剂后,应立即上机扩增,以免形成过多的二聚体。
2. 阳性模板可用阳性血清代替,处理方法同上。
3. 阳性模板及DNA提取液使用前需充分融化离心。
4. 反应也的表面为固体封盖剂,电泳取样时从反应管底部洗液。
5. EB为强致癌物,操作过程应注意防护。
6. 注意无菌操作,以免出现假阳性