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南京亿迅生物科技有限公司
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腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶
2019-11-19 阅读(341)
| 提 供 商 | 南京亿迅生物科技有限公司 | 资料大小 | 26.5KB |
|---|---|---|---|
| 资料图片 | 下载次数 | 69次 | |
| 资料类型 | WORD 文档 | 浏览次数 | 341次 |
测定意义
AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中，催化葡萄糖-1-磷酸与ATP反应生成淀粉合成的直接前体ADPG，是植物淀粉生物合成的主要限速步骤。
测定原理
AGP催化的逆向反应生成G1P，在反应体系中添加的磷酸己糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，340nm下测定NADPH增加速率，即可计算AGP活性。
需自备的的仪器和用品
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水
试剂的组成和配制
提取液：液体30mL×1瓶，4℃保存;
试剂一：液体10mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1支，4℃保存；临用前加入250μL双蒸水充分溶解备用；用不完的试剂仍4℃保存；
试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入2mL双蒸水充分溶解备用；用不完的试剂仍4℃保存；
试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入3mL双蒸水充分溶解备用；用不完的试剂仍4℃保存；
试剂五：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入3mL双蒸水充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存；
试剂六：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加入250μL双蒸水充分溶解备用；用不完的试剂4℃保存；
试剂七：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加入250μL双蒸水充分溶解备用；用不完的试剂4℃保存；
粗酶液制备
称取约0.1g组织加入1mL提取液，冰浴中匀浆。10000g ，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤（在1.5mL EP管中依次加入下列试剂）：
试剂名称（μL） | 测定管 |
试剂一 | 100 |
试剂二 | 10 |
试剂三 | 50 |
试剂四 | 100 |
样本 | 20 |
混匀，30℃保温15 min，置沸水浴中1 min（盖紧，防止水分散失），冰浴迅速冷却
试剂五 | 100 |
试剂一 | 300 |
试剂六 | 10 |
试剂七 | 10 |
混匀后立即在340 nm波长下记录初始吸光度A1和 2min后的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。
AGP活性计算
1、按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活性单位。
AGP活性（U/mg prot）＝反应总体积（700μL ）÷样本体积（20μL ）÷反应时间(2min)÷NADPH消光系数（6.22×10-3）×ΔA÷蛋白质浓度（mg/mL）=2813×ΔA÷蛋白质浓度（mg/mL）。
此法需要自行测定粗酶液蛋白质浓度。
2、按照样本鲜重计算
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
AGP活性（U/g 鲜重）=反应总体积（700μL ）÷样本体积（20μL ）÷反应时间(2min)÷NADPH消光系数（6.22×10-3）×ΔA ÷样本鲜重(g/mL) =2813×ΔA÷样本鲜重(g/mL)
