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南京亿迅生物科技有限公司
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更新时间：2019-11-07 11:04:34浏览次数：531
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线粒体异柠檬酸脱氢酶(ICDHm)检测试剂盒
测定原理
ICDHm催化NAD+ 还原生成NADH，导致340nm处光吸收上升。
需自备的仪器和用品
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制
试剂一：50mL×1瓶，-20℃保存；
试剂二：10mL×1瓶，-20℃保存；
试剂三：1mL×1支，-20℃保存；
试剂四：液体60mL×1瓶，4℃保存；
试剂五：粉剂×1支，4℃保存；
试剂六：粉剂×1支，-20℃保存；
试剂七：粉剂×1支，-20℃保存; 临用前加入3mL双蒸水充分混匀待用，用不完的试剂仍-20℃保存。
工作液的配制：临用前把试剂五、试剂六转移到试剂四中混合溶解待用。
ICDHm的提取
- 准确称取约0.1g组织或收集约500万细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵研磨。
- 4 ℃ 600 g离心5min。
- 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，4 ℃ 11000 g离心10min。
- 上清液即胞浆提取物，可用于测定可能从线粒体泄漏的ICDHm（此步可选做）。
- 在沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（功率20％，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体ICDHm活性测定。
测定步骤
- 调零
用蒸馏水于340nm处调零。
1）取1mL工作液加入1mL石英比色皿，在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min。
（2）取出比色皿，再依次加入60μL试剂七和80μL样本，混匀；加入样本的同时开始计时，立即记录340nm处20s的吸光值A1，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）中准确反应2min，记录340nm处2min20s时的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。
注意事项
1、测定过程中所有试剂和样本在冰上放置，以免变性和失活。
2、比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
3、两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
线粒体异柠檬酸脱氢酶(ICDHm)检测试剂盒
