细胞分选常见问题

问题一

为什么建议磁珠分选而不是流式分选？

1)磁珠分选需要的设备简单，而流式分选需要配备分选型流式细胞仪，价格较为昂贵，而且流式分选对于操作员的技术要求很高，需要专门的培训并有一定的经验后才能很好地完成流式分选；

2)磁珠分选所需要的时间远小于流式分选所需要的时间；

3)磁珠分选对于目的细胞的刺激比流式分选要小，流式分选过程中需要对目的细胞所在的液滴通电，并且需要经过一个强电场的区域，对目的细胞的刺激相对较大；磁珠分选只是让细胞处于一个低磁场中，基本可以忽略对细胞的影响，从保持细胞活力的方面考虑，磁珠分选要优于流式分选。

因此，如果磁珠分选可以满足实验需求时，应尽量选择磁珠分选的方法。

问题二

磁珠分选为什么要求细胞活性越高越好？

1)死细胞分泌DNA，DNA有粘性，会将磁珠标记细胞和非标记细胞粘在一起，如果是阳选会影响纯度，如果是阴选会影响得率。

2)细胞活性低时可能会影响抗原抗体的结合效率。

问题三

磁珠分选buffer是什么？

autoMACS running buffer（自己配制：pH7.2 PBS，0.5％BSA、2mM EDTA，如需无菌，建议购买商品化buffer或紫外线照射，不建议高温高压灭菌）。

问题四

如果想分选的细胞有多个阳性marker怎么办？

可以选择磁珠分选阴选+阳选的方法，eg.分选小鼠脾脏naive CD4+T可以先用阴选的方法分到CD4+T细胞再用CD62L磁珠阳性分选；也可以用磁珠+流式的方法。

问题五

分选柱可以二次使用吗？

不建议，主要是分选柱内填充的铁珠在使用后易生锈。

问题六

 分选柱应如何选择？

不同的试剂盒对于MS/LS/LD柱的最大细胞上样量和最大磁性细胞吸附量是不同的，建议一定要参考说明书；

此外，如分选的目的细胞较大（eg.巨核细胞或fibroblast），可考虑采用large cell colums。

磁珠分选- 方案A：MagniSort™阳性分选

引言

下述方案是MagniSort™阳性分选试剂盒的通用操作指南。具体请参见试剂盒内的说明书。在阳性分选中，待分选的细胞首先与标记的抗体结合，然后被链酶亲合素包被的磁珠捕获。将细胞放入MagniSort™磁座后，阳性细胞被磁场吸住，而阴性细胞仍游离在溶液中，可被弃掉。每个试剂盒中的化抗体和磁珠预先已滴定好最适浓度，为即用型试剂。

注意事项

注：MagniSort™ 5mL磁座可产生强磁场。应远离心脏起搏器、、磁性身份卡、手表、计算机显示器、硬盘等物品，以免损坏。

细胞制备

1. 在未特别说明的情况下，MagniSort™阳性分选试剂盒已优化，适用于小鼠二级淋巴组织或正常人PBMC。

2. 用于小鼠细胞时，建议用40μm的尼龙细胞筛清除碎屑，以使试剂盒发挥出最佳效果。

3. 正常人PBMC的制备，参见“细胞制备-方案D：从全血中提取PBMC"（第28页）。为使MagniSort™试剂盒发挥最佳性能，建议洗涤白膜层，去除血小板。

4. 向缓冲液中加入EDTA减少细胞聚集。

后续用于无菌培养

1. MagniSort™阳性分选抗体和阳性分选磁珠中含有少量作为防腐剂。当使用不含的无菌缓冲液时，它不会影响细胞功能。需要根据测试判断在特定实验中的性能。

2. 分选无菌细胞时应该在超净工作台中进行，并使用带盖的聚苯乙烯无菌试管和无菌缓冲液。

提供的材料

ƒ MagniSort™阳性分选抗体，200次试验，20μL/次试验。2-8°C贮存。

ƒ MagniSort™阳性分选磁珠，4mL。2-8°C贮存。

所需其他材料

ƒ 细胞分选推荐使用的缓冲液：添加3%胎牛血清（FBS）和10mM EDTA的PBS或Hank（HBSS）。2-8°C贮存。

ƒ MagniSort™磁座，5mL。

ƒ 12 x 75 mm流式管(5 mL，BD Falcon™，货号352008或类似产品)。

ƒ 15mL离心管(BD Falcon™，货号352099或类似产品)

实验步骤

1. 用适当的细胞分离液，制备浓度为1x107细胞/100μL（1 x 108/mL）的淋巴细胞悬液。

注：细胞必须制成单细胞悬液。实验前需要检查样本，必要时用涡旋法或移液器去除细胞团块。

2. 将所需数量的细胞（不能超过2 x 108个细胞）放入12 x 75 mm的5mL试管中。

3. 每100μL细胞中加入20μLMagniSort™阳性分选抗体。涡旋5次混匀。室温孵育10分钟。

4. 加入细胞分离液洗涤细胞，使其总体积达到4mL，在300xg下离心5分钟。

5. 弃上清，然后用细胞分离液重悬细胞至最初的体积。

注：细胞必须制成单细胞悬液，实验前需要检查样本，必要时用涡旋或移液器去除细胞团块。

6. 每100μL细胞中加入20μLMagniSort™阳性分选磁珠。涡旋5次混匀。室温孵育10分钟。

注：为确保最佳性能，将MagniSort™阳性分选磁珠加入细胞之前必须充分混匀。将设定为1mL的Pipetman™ P1000移液器上下吹打5次，或者采用涡旋的方式重悬磁珠。7. 用细胞分离液将体积加至2.5mL。将设定为1mL的Pipetman™P1000移液器上下吹打3次，使其混匀。不能涡旋。

8. 将试管插入磁座中间的孔底，室温孵育5分钟。

9. 拿起磁座将试管内的上清液倒入废液容器内；这些是不需要（未结合）的细胞。将试管倒置1秒钟，然后回正。注：切勿吸干或摇晃倒置后的试管，否则会降低回收率。如果需要也可以收集起结合细胞。

10. 从磁座中取出试管并重复7-9步两次，总共洗涤细胞3次。

11. 从磁座中取出含目标细胞的试管，加入1mL细胞分离液。沿着试管侧壁加入缓冲液，洗涤试管侧壁。此时，试管内就是分选的阳性细胞，备用。

磁珠分选 -方案B：MagniSort™阴性分选

简介

以下是MagniSort™阴选试剂盒的通用操作指南，该试剂盒适用于细胞进行阴性分选。具体请参见每个试剂盒内的说明书。在阴性分选中，不需要的细胞与bition化抗体混合液结合，然后加入链霉亲和素包被的磁珠。将细胞放入MagniSort™磁座后，不需要的细胞被磁场吸住，而需要的细胞游离在溶液中，将其倒出后即可使用。每个试剂盒中的ition化抗体和磁珠已预先滴定好最适浓度，为即用型试剂。

注意事项

注意：MagniSort™ 5mL磁座可产生强磁场。应远离心脏起搏器磁性身份卡、手表、计算机显示器、硬盘等物品，以免损坏。

细胞制备

1. 在未特别指明的情况下，MagniSort™ 阴选试剂盒已经过优化，专门适用于小鼠二级淋巴组织或正常人PBMC。

2. 用于小鼠细胞时，建议用40μm的尼龙细胞筛清除碎屑，以使试剂盒发挥出最佳效果。

3. 正常人PBMC的制备，参见“细胞制备-方案D：从全血中提取PBMC"（第28页）。为使MagniSort™试剂盒发挥最佳性能，建议洗涤白膜层，去除血小板。

4. 缓冲液中加入EDTA减少细胞聚集。

后续用于无菌培养

1. MagniSort™阴选抗体混合液和阴性分选磁珠中含有少量作为防腐剂。当使用不含的无菌缓冲液时，它不会影响细胞功能。需要根据测试判断在特定实验中的性能。

2. 分选无菌细胞时应该在超净工作台中进行，并使用带盖的聚苯乙烯无菌试管和无菌缓冲液。

提供的材料

ƒ MagniSort™阴选抗体混合液，200次实验，20μL/次试验。2-8°C贮存。

ƒ MagniSort™阴性分选磁珠，4mL。2-8°C贮存。

所需其他材料

ƒ 细胞分选推荐使用的缓冲液：PBS或添加3%FBS和10mM EDTA的HBSS。2-8°C贮存。

ƒ MagniSort™磁座，5mL

ƒ 12 x 75 mm流式管(5 mL, BD Falcon™, 货号352008或类似产品)

实验步骤

1. 用适当的细胞分离液，制备浓度为1x107细胞/100μL（1 x 108/mL）的单细胞悬液。

注：细胞必须制成单细胞悬液。实验前需要检查样本，必要时用涡旋法或移液器去除细胞团块。

2. 将所需数量的细胞（不能超过2 x 108个细胞）放入12 x 75 mm的5mL试管中。

3. 每100μL细胞中加入20μLMagniSort™阴选抗体混合液。涡旋5次混匀。室温孵育10分钟。

4. 用细胞分离液洗涤细胞，使其总体积达到4mL，300xg离心5分钟。

5. 弃上清，然后用细胞分离液重悬细胞至最初的体积。

注：细胞必须制成单细胞悬液。实验前需要检查样本，必要时用涡旋法或移液器去除细胞团块。

6. 向每100μL细胞中加入20μL MagniSort™阴性分选磁珠。涡旋5次混匀。室温孵育5分钟。

注：为确保最佳性能，将MagniSort™阴性分选磁珠加入细胞之前必须充分混匀。将设定为1mL的Pipetman™ P1000移液器上下吹打5次，重悬磁珠，不能涡旋。

7. 用细胞分离液将体积加至2.5mL。将设定为1mL的Pipetman™P1000移液器上下吹打3次，使其混匀。不能涡旋。

8. 将试管插入磁座中间的孔底，室温孵育5分钟。

9. 拿起磁座以连续的动作将试管内的上清液倒入一支新的12x75 mm 5mL试管中并将磁座内的试管倒置1秒钟，然后回正。

注：切勿吸干或摇晃倒置后的试管，否则会降低未结合细胞的纯度。

10. 将磁座中的试管丢弃。

11. 此时，新5mL 12 x 75 mm试管中的阴性细胞即为分选后的目的细胞，备用。

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