DNA甲基化检测（重亚硫酸盐处理）试剂盒

       DNA甲基化是一种基本的表观遗传学修饰，在基因表达调控、发育调节、基因组印迹等方面发挥重要作用。在DNA甲基转移酶的催化下，CpG双核苷的胞嘧啶第5 位碳原子被选择性地添加甲基基团。 在人类肿瘤中，普遍发生甲基化异常的现象，由于甲基化与胚胎发育、细胞周期调控相关，因此DNA甲基化状态的变化可作为疾病诊断和预后的一个有用的指示器。

       最早在1970年，重亚硫酸盐转化就被用于鉴别DNA中的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶（5-mC）。现在认为在重亚硫酸盐处理过程中，5-甲基胞嘧啶（5-mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）都不会发生碱基的变化，因此这种方法不能用来区别不同的甲基化修饰。在重亚硫酸盐转化过程中，DNA首先用重亚硫酸钠处理，在高温和低pH条件下，将变性DNA（单链DNA）中的胞嘧啶转化为胞嘧啶-重亚硫酸盐衍生物，这个反应是可逆的；接下来胞嘧啶-重亚硫酸盐衍生物发生不可逆的水解脱氨基过程，形成尿嘧啶-重亚硫酸盐衍生物。最后在高pH条件下尿嘧啶-重亚硫酸盐衍生物脱磺酸基形成尿嘧啶。只有未甲基化的胞嘧啶在重亚硫酸盐处理下发生碱基变化， 5-mC和5-hmC仍然保持不变。转化处理后的DNA经PCR扩增，尿嘧啶（U）转变为胸腺嘧啶（T）。重亚硫酸盐转化示意图如下：

图1 重亚硫酸盐处理将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶

       Active motif公司的Bisulfite Conversion Kit提供优化的转化试剂、简单易用的操作步骤以及阳性对照PCR引物，简化了DNA甲基化检测的过程。整个转化可在1.5小时之内完成，转化效率高达99%。试剂盒提供转化特异性PCR引物，可用于测序前验证重亚硫酸盐转化效率。阳性对照PCR引物适用于重亚硫酸盐转化处理的人和小鼠DNA，经PCR扩增可得到220 bp的产物。

Active motif同时也提供MethylDetector™重亚硫酸盐修饰试剂盒，该试剂盒是Active motif公司最初提供的一款DNA甲基化检测试剂盒，原理和Bisulfite Conversion Kit一样，但转化时间需要5小时。

图2 Bisulfite Conversion Kit 操作流程

使用Bisulfite Conversion Kit，将目的DNA用蛋白酶K处理，加入重亚硫酸盐转化试剂和DNA变性剂，在温度循环仪中进行快速热变性。经过1.5小时的DNA转化反应，样品加入到试剂盒里的DNA纯化柱，脱盐后洗脱DNA，可用于PCR或其他的下游实验。

图3 阳性对照转化特异性PCR引物可用于特异性扩增转化后的人和小鼠DNA

使用Bisulfite Conversion Kit处理人（A）和小鼠（B）基因组DNA，处理（Bis）和未处理（Untr）的DNA分别用阳性对照转化特异性PCR引物进行PCR扩增分析。阳性对照PCR引物专门适用于经重亚硫酸盐转化的DNA，因此会扩增出220bp的条带，而未处理的DNA没有扩增出相应条带。