产品信息

产品简介

鬼笔环肽（Phalloidin）的结合阻止丝状肌动蛋白（微丝）的解离，稳定微丝结构，从而破坏微丝的聚合-去聚合的动态平衡。此特性使得肌动蛋白聚合发生的临界浓度（CC）降至＜1µg/mL，因此，可用作一种聚合促进剂。此外，鬼笔环肽还可抑制F-actin的ATP水解活性。

本品为鬼笔环肽-iFluor 700标记探针会选择性地结合F-肌动蛋白。以纳摩尔浓度使用，鬼笔环肽衍生物是方便的探针，用于标记，鉴定和定量甲醛固定和透化组织切片中的F-肌动蛋白，细胞培养物或无细胞实验。肌动蛋白是一种球状的，大约42kDa的蛋白质，几乎存在于所有真核细胞中。 它也是最高度保守的蛋白质之一，与藻类和人类不同的物种相差不超过20％。 肌动蛋白是细胞中两种细丝的单体亚基：微丝，细胞骨架的三个主要组分之一，以及微丝，是肌细胞中收缩装置的一部分。 因此，肌动蛋白参与许多重要的细胞过程，包括肌肉收缩，细胞运动，细胞分裂和胞质分裂，囊泡和细胞器运动，细胞信号传导，以及细胞连接和细胞形状的建立和维持。

Warbio生物以1000×储存液形式（溶于DMSO）提供，按照100µl/孔（96孔板），总共可做300T。

注意事项：   

鬼笔环肽  的分子量小，很容易通过细胞，不需要对细胞进行冷丙酮和TRITON X-100处理。毒性较大，戴上手套操作。

有几种方法都能用来染色组织细胞培养物内的肌动蛋白丝（F-actin）染色，其中，固定步骤在获得可信且具代表性的细胞F-actin分布情况中至关重要。固定步骤基于实验自身需求来选择。多聚甲醛或戊二醛都能得到优秀的F-actin染色和良好的板状伪足维持保存。

一、实验材料准备

1.1 iFluor 700Phalloidin（货号LX4713）

1.2 1×PBS Buffer（pH 7.4）, for Cell Culture（货号 SH30256.01）

1.3 固定液（溶于PBS的4%多聚甲醛，pH 7.0）

1.4 破膜液（溶于PBS的0.5% Triton X-100）

1.5 （可选）抗荧光淬灭剂

1.6 （可选）即用型PI染色液（货号 4209）

1.7 （可选）BSA, Standard Grade（货号 J8660）

1.8 黑框/透明底的96孔细胞培养板

二、染色工作液准备

2.1 于实验前将低温保存的iFluor700Phalloidin置于室温回温至少20min，低速离心后才开瓶。第一次使用请将本品按照单次用量进行分装，置于-20℃避光保存，一年稳定。

2.2 本品以1000×DMSO储存液形式提供。开始实验前，使用1×PBS Buffer（pH 7.4）将其稀释到1×染色工作液（比如1µl储存液加入1ml PBS Buffer），用枪吹匀即可。

【注①】：以96孔板为检测体系，按照100µl/孔来计算，准备足量的染色工作液；也可对细胞爬片进行染色，但需调整染色工作液的用量，以能覆盖住细胞为准。

【注②】：最佳的工作浓度和孵育时间取决于特定的应用。根据特定的细胞类型和/或细胞/组织对探针的通透性来调整合适的染色条件。

【注③】：可使用含1% BSA的PBS Buffer稀释储存液，能够降低非特异背景染色，也能最小化鬼笔环肽粘附到管壁的可能性。

【注④】：染色工作液现配现用，室温避光保存。

三、染色流程（以96孔板为例）

3.1 用黑框/透明底的96孔板进行细胞培养，使其贴壁生长达到70-80%的汇合度。

3.2 吸掉培养液，用37℃预热的1×PBS Buffer（pH 7.4）清洗细胞2次。

3.3 用溶于PBS的4%多聚甲醛固定细胞，室温固定10-30min。【注意】：固定过程中甲醇能破坏肌动蛋白，因此，固定液中最好避免接触任何甲醇。固定液是无甲醇的甲醛。

3.4 用1×PBS Buffer清洗细胞2-3次，室温下30s/次。

3.5 用破膜缓冲液透化细胞，室温处理5min。

3.6 用1×PBS Buffer清洗细胞2-3次，室温下30s/次。

3.7 取100μl现配的iFluor 700Phalloidin染色工作液到每个孔内，室温避光孵育30-90min。

【注意】：若有需要，此时可加入即用型PI染色液或其他不同于iFluor 700荧光光谱的细胞核染色液。

3.8 用1×PBS Buffer清洗细胞2-3次，室温下30s/次。

3.9 加抗荧光淬灭剂（如Fluoromount-GTM）到孔内保护荧光。

3.10 荧光显微镜下观察染色结果，选择iFluor 700激发/发射滤片（Ex/Em=690/713nm）。

相关产品