正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定                                             

测定意义：

生物体内超氧阴离子等活性氧具有免疫和信号传导的作用，但积累过多时会对细胞膜及生物大分子产生破坏作用，导致机体细胞和组织代谢异常，从而引起多种疾病。

测定原理：

超氧阴离子与盐酸羟胺反应生成NO₂^－，NO₂^－在对氨基苯磺酸和α－萘胺的作用下，生成红色的偶氮化合物，在530nm处有特征吸收峰，根据ΔA值可以计算样品中O₂^－含量，反应式为NH₂OH + 2O₂^－ ＋H^＋ → NO₂^－ ＋ H₂O₂ ＋ H₂O。

试剂组成和配制：

自备仪器和用品：

天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、氯仿和蒸馏水。

超氧阴离子提取：

1、植物、动物组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液）进行冰浴匀浆，然后，10000g，4℃，离心20min，取上清置于冰上待测。

2、细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1ml提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心20min，取上清置于冰上待测。

3、血清或培养液：直接测定。

测定步骤：

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至530nm，蒸馏水调零。

2、加样表

混匀，37℃水浴20min

混匀，37℃水浴20min

混匀，8000g，25℃，离心5min，小心吸取上层水相200μl于微量石英比色皿/96孔板中，测定A530。ΔA=A测定-A空白，空白管只要做一管。

超氧阴离子含量计算公式：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.0242x - 0.0027，R²=0.9980

1. 组织：

（1）按照样本质量计算

超氧阴离子含量（nmol/g 鲜重）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V反总÷(V样÷V样总×W)×2

                             =148.76×(ΔA+0.0027)÷W

超氧阴离子产生速率（nmol/ g·min）=148.76×(ΔA+0.0027)÷W÷T

                                =7.44× (ΔA+0.0027)÷W

（2）按照蛋白质浓度计算

超氧阴离子含量（nmol/mg prot）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V反总÷(V样×Cpr)×2

                                             =148.76×(ΔA+0.0027)÷Cpr

超氧阴离子产生速率（nmol/ mg prot·min）= 148.76×(ΔA+0.0027)÷Cpr÷T

                                      =7.44× (ΔA+0.0027)÷Cpr

2. 细菌，真菌：

超氧阴离子含量（nmol/10⁴ cell）= (ΔA+0.0027)÷0.0242× V反总÷(V样÷V样总×细胞数量)×2

= 148.76×(ΔA+0.0027)÷细胞数量

超氧阴离子产生速率（nmol/10⁴ cell·min）= 148.76×(ΔA+0.0027)÷细胞数量÷T

=7.44× (ΔA+0.0027)÷细胞数量

3. 血清或培养液

超氧阴离子 含量（nmol/ml）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V反总÷V样×2

=148.76× (ΔA+0.0027)

超氧阴离子产生速率（nmol/ml·min）= 148.76× (ΔA+0.0027) ÷T

= 7.44× (ΔA+0.0027)

V样总：加入提取液体积，1 ml； V反总：反应总体积，0.36ml；V样：反应中样品体积，0.2ml；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样品质量，g；T：反应时间，20min；2: 2分子O₂^－参与反应生成1分子NO₂^－。

b.用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.0121x - 0.0027，R² = 0.9980

1. 组织：

（1）按照样本质量计算

超氧阴离子含量（nmol/g 鲜重）= (ΔA+0.0027)÷0.0121×V反总÷(V样÷V样总×W)×2

                             =297.52× (ΔA+0.0027)÷W

超氧阴离子产生速率（nmol/ g·min）=297.52× (ΔA+0.0027)÷W÷T

                                =14.88× (ΔA+0.0027)÷W

（2）按照蛋白质浓度计算

超氧阴离子含量（nmol/mg prot）= (ΔA+0.0027)÷0.0121×V反总÷(V样×Cpr)×2

                                             =297.52× (ΔA+0.0027)÷Cpr

超氧阴离子产生速率（nmol/ mg prot·min）= 297.52× (ΔA+0.0027)÷Cpr÷T

                                      =14.88× (ΔA+0.0027)÷Cpr

2. 细菌，真菌：

超氧阴离子含量（nmol/10⁴ cell）=(ΔA+0.0027)÷0.0121× V反总÷(V样÷V样总×细胞数量)×2

=297.52× (ΔA+0.0027)÷细胞数量

超氧阴离子产生速率（nmol/10⁴ cell·min）=297.52× (ΔA+0.0027)÷细胞数量÷T

=14.88× (ΔA+0.0027)÷细胞数量

3. 血清或培养液

超氧阴离子 含量（nmol/ml）=(ΔA+0.0027)÷0.0121 ×V反总÷V样×2

=297.52×(ΔA+0.0027)

超氧阴离子产生速率（nmol/ml·min）= 297.52×(ΔA+0.0027) ÷T

=14.88×(ΔA+0.0027)

V样总：加入提取液体积，1 ml； V反总：反应总体积，0.36ml；V样：反应中样品体积，0.2ml；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样品质量，g；T：反应时间，20min；2：2分子O₂^－参与反应生成1分子NO₂^－。

注意事项：

1、OD值大于1，样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数。

2、样品制备好后，立刻进行测定，请勿将样品进行长时间的低温保存，以免影响测定结果。

3、试剂四有一定的毒性，请操作时做好防护措施。