减少或消除PCR反应中的引物二聚体过程

实时荧光定量 PCR 分析的部分实施需要经过优化以确保所有反应参数均设置精确，从而获得准确的结果。如果出现了引物二聚体，有许多方法可以减少或消除反应中的引物二聚体。

1、首先是优化热循环条件，这主要是提高退火温度。大多数情况下，两步循环 (由 95°C 变性步骤直接进入60°C 退火和延伸步骤) 有利于强效扩增，因此引物设计时设定的成功退火温度为 60°C。 

2、可降低引物浓度，甚至采用不同的正向引物和反向引物的比值也有一定的帮助。大多数情况下，每条引物的理想最终浓度为 200 nM，但如有需要，可将浓度降至 60 nM。 

3、镁的最佳浓度一般约为 3 mM。高于此浓度易形成引物二聚体。

4、如果未对引物形成二聚体的倾向进行评估，则应补充评估并考虑重新设计 (如有需要)。通常情况下，最好使用热启动 DNA 聚合酶，并在冰上进行反应。

5、在理论上，针对同一靶点应同时检测多个引物组。这实际上可以节省大量时间，因为如果这些引物中的一个能立即发挥作用，则可以减少花费在优化过程上的时间。