细胞冻存操作注意事项

  随着温度降低，细胞内的酶活性会逐渐降低，到-70℃左右，酶活性几乎为0，代谢活动停止，可以实现长期保存。然而，随着温度降低，细胞内外的水分也会“结冰"并形成冰晶，冰晶能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。因此常加入冷冻保护剂甘油或二甲基亚砜（DMSO）。DMSO能快速穿透细胞膜进入细胞，降低冰点，延缓冻存过程，同时增加细胞膜的通透性，提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而达到保护细胞的目的。

  细胞如果要长期保存，需要冻存起来放液氮保存。那怎么样冻存细胞才能保证细胞能正常复苏，不至于冻存死亡呢？下面我们就来讲讲细胞冻存应该注意的一些地方。

1. 保持冻存前细胞状态良好

冻存前一定要保证细胞状态良好，细胞处于对数生长期，否则不管后面怎么处理，冻存后的细胞状态必然有影响。若细胞密度偏高，培养基已经略微变黄，细胞状态正常，需要换液培养2h以上再冻存细胞；若已*变黄，细胞死亡超过20%，需要传代后再重新培养至状态正常后再冻存细胞。

2. 消化、吹打细胞按尽量轻柔
如何正确消化、吹打细胞在前面已经讲过了，有兴趣的话可以到以往文章里看看，这里就不再赘述了。冻存后细胞培养瓶和培养皿肯定还是会残留一点细胞，这些残留的细胞加新的培养基继续培养，如果培养正常就可以看出冻存时消化、吹打操作是没有问题的，如果直接死了或者状态不好，那冻存的细胞自然也好不到哪里去，问题出在哪就很明显了。

3. 冻存液配方要给合适的
冻存液配方这个其实不同实验室都有自己的习惯，有FBS+10%DMSO的，也有*培养基+10%DMSO的，还有基础培养基+血清+DMSO=7:2:1 6:3:1 5:4:1，可以说是五花八门，但总体来说，DMSO一般是不超过12%的，血清浓度越高冻存效果也越好，因此需要多冻几次对比合适的配方。

4. 冻存液要提前配置
冻存液使用时要提前配好，不能直接在细胞悬液中加DMSO冻存细胞，否则DMSO溶解时浓度不均加上溶解放热会损伤细胞活性。可以现配先用，也可以多配一点，4度最多可以保存3个月，-20度可以保存一年。细胞用冻存液重悬后应尽快放到4度或者程序性冻存盒开始冻存，避免长时间室温状态，因为室温条件下DMSO对细胞是有害的。

5. 冻存细胞数量选择
通常来说，冻存细胞都会有一部分细胞死亡，所以冻存剩下的活细胞数量才是决定细胞复苏后能否正常养起来的关键。一般冻存不容易死的细胞数量每管在100-200万就够了，一些冻存很容易死的细胞，比如NK92、THP-1、SF9等细胞数量要稍微高点，300-400万左右为宜。冻存液一般1ml左右每管，这个基本每个实验室都差不多。

6. 冻存程序选择
冻存的时候可以选择用程序性冻存盒直接放到-80度冻存细胞，但要记得异丙醇要及时更换，一般用4-5次异丙醇含水量就超标了，不再适合冻存细胞使用。也可以将冻存管依次在4度10min，-20度2h，-80过夜后液氮保存。-80度不适合细胞长期保存，只能短期保存，最好不要超过一周，否则有部分细胞系活性可能会下降很厉害，长期保存的细胞最好放液氮罐保存。

7. 注意冻存检查
冻存细胞后应在同一批次内随机选一只细胞复苏检测冻存效果， 如果复苏效果不佳的话需要找到问题所在摸索合适条件重新冻存细胞，如果复苏良好的就可以放到液氮里长期保存了。这个也是前面推荐将冻存剩下的细胞继续培养的原因，可以有效避免细胞冻存失败导致绝种