类器官蛋白提取方法

类器官蛋白提取方法：

一、试剂准备（细胞浆、细胞核及细胞膜蛋白抽提试剂盒）

1、准备溶液

1）室温融解试剂盒中的各种溶液，溶解后除结构蛋白提取液外，其他试剂立即置于冰上；

2）结构蛋白提取液溶解后，可放置于37℃水浴中温浴至透明后，常温放置。

2、蛋白提取工作液的准备

1）胞浆蛋白提取工作液的准备：临用前，根据处理样品的量估算实验时胞浆蛋白提取液的需要量，并分别按照1:50比例加入磷酸酶抑制剂II和1:100比例加入蛋白酶抑制剂PMSF；

2）胞核蛋白提取工作液的准备：临用前，根据处理样品的量估算实验时胞核蛋白提取液的需要量，并分别按照1:50比例加入磷酸酶抑制剂II和1:100比例加入蛋白酶抑制剂PMSF；

3）膜蛋白提取工作液的准备：临用前，根据处理样品的量估算实验时膜蛋白提取液的需要量，并分别按照1:50比例加入磷酸酶抑制剂II和1:100比例加入蛋白酶抑制剂PMSF；

4）结构蛋白提取工作液的制备：临用前，根据处理样品的量估算实验时结构蛋白提取液的需要量，并分别按照1:50比例加入磷酸酶抑制剂II和1:100比例加入蛋白酶抑制剂PMSF。

二、类器官收集及洗涤

1、类器官收集

移液器吸去培养基，每孔添加1-2mL左右4℃类器官传代培养缓冲液(abs9730)，轻柔吹打基质胶，收集在15mL离心管中（24孔板，每5孔为一组），4℃静置10min或-20℃放置5min（目的是使基质胶软化），300g ，4℃， 离心5min弃上清。

2、类器官清洗

添加1mL类器官传代培养缓冲液重悬，300g ，4℃，离心5min弃上清。

三、类器官蛋白提取

1、胞浆蛋白提取

1）向含类器官沉淀的EP中加入2mL的胞浆蛋白提取工作液，在4℃条件下震荡20min；

2）准备1-5mL的注射器，用注射器吹打步骤1震荡过的溶液50-90次，在4℃条件下，15000g离心10min。取上清液存于EP管中，即为胞浆蛋白。

2、胞核蛋白的提取

取3.1.2步骤获得的沉淀物加入4mL冰浴的胞浆蛋白提取工作液，在4℃条件下震荡5min，4℃条件下15000g离心10min，弃去上清液，沉淀物中加入1mL冰冻的胞核蛋白提取工作液，在4℃条件下震荡5min，4℃条件下15000g离心10min，上清液为细胞核蛋白，转入EP管并保存。

3、胞膜蛋白的提取

在步骤3.2中的沉淀物中加入1mL冰冻的膜蛋白提取工作液，在4℃条件下震荡5min，4℃条件下15000g离心10min，上清液为细胞膜蛋白，转入EP管并保存。

4、结构蛋白的提取

在步骤3.3的沉淀物中加入常温或37℃水浴过的透明的结构蛋白提取工作液0.5mL，4℃条件下震荡5min，4℃条件下15000g离心10min，保存上清液即为细胞骨架蛋白。

5、待测蛋白的保存待检测浓度的蛋白存于-70℃，可以用于Western，EMSA，footprinting，报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。