转化叙利亚地鼠胚胎细胞实验实验步骤

转化叙利亚地鼠胚胎细胞实验实验步骤:

1、取材:妊娠后第13天取材,取数个同窝胚胎,去头和内脏,在无菌条件下剪碎至米粒大小,再用0.25％ (含0.01％EDTA)37℃消化30分钟,滤过、低速离心、吸除消化液、加入营养液、制备成细胞悬液、接种入75cm/培养瓶中,接种密度10～20×106/75cm,37℃培养2～3天,在顺利情况下能迅速长满瓶面.

2、贮存:选大批生长状态良好的细胞冻存,储以备用.

3、致癌物处理:取冻存细胞,解冻,接种于25ml培养瓶中,每瓶含细胞10万～30万.待 细胞生长 进入指数增生期时,向培养瓶中加入致癌剂MNNG.致癌剂量1～3微克/毫升营养液.在37℃温箱中培养12～48小时.

4、低血清培养:弃掉MNNG作用液,用温 PBS 洗1～3次,加入含20％小牛血清,继续置温箱中培养2～3周,然后改用含5％血清培养液培养.低血清培养液不利于正常细胞生长,但已转化的细胞仍能增殖和形成转化灶.

5、转化灶形成和分离:在成功情况下,用致癌物处理过的细胞于10天后在正常细胞之间,可产生数量不等的转化灶.