浅谈普通荧光染色基本实验步骤

荧光染色是分子生物学中常用的一种实验技术。今天，我们来浅谈荧光染色的一些基本实验步骤。这里以细胞实验中普通荧光染色为主，展开对实验步骤的介绍。

对荧光信号的检测常用的仪器主要有普通荧光显微镜和激光共聚焦显微镜。因此，一般需要准备爬片或者是激光共聚焦培养皿。

爬片：是一种经过特殊表面处理的玻片，常用的一般是24孔板配套的14mm直径圆形玻片。除此之外还有6孔板，12孔板，48孔板等不同规格的爬片。经过特殊处理的爬片可以让细胞很好地黏附，但遇到粘附性极差地细胞，要保证它们正常黏附，可以使用细胞贴壁黏附剂，促进其贴壁能力。

激光共聚焦培养皿：是一种中间有凹槽的小皿，用它的好处在于可以省去爬片制作的流程，但也要注意的是，有的普通荧光显微镜是无法检测激光共聚焦培养皿中的细胞，所以大家也要根据实验条件选择适宜的载体。

选择好载体后，接下来要做的就是细胞接种。细胞接种的密度在1*105-1*106之间，因为不同细胞生长速度不一样，可以大致摸一下最适细胞接种浓度。将细胞以最适浓度接种于含爬片的24孔板内或者激光共聚焦培养皿中，放入细胞培养箱24小时（培养时间可以根据需要调整），使细胞贴壁。然后就是对细胞进行相应的处理，比如药物啊，根据实际情况选择。

处理结束后，用4%多聚甲醛对细胞进行固定10-15min，用PBS进行漂洗两到三次。Triton X-100对细胞进行通透，增强细胞膜通透性，便于荧光染料进入细胞。

荧光染色：按荧光试剂盒说明书操作

复染：一般用DAPI染核（确定核的位置），DAPI染料染10min,PBS漂洗两到三次。

封片：取出爬片。操作小技巧，最后漂洗的PBS留在孔内，不要吸出来，一手持镊子，一手持注射针，用针尖将爬片挑起（如果能将针尖弯成一个小钩，就更方便了），镊子取出，在载玻片上滴上约20ul封片剂（抗荧光猝灭剂），将带细胞一面朝下，使封片剂均匀覆盖爬片。激光共聚焦培养皿就无须取出爬片了。

采集图像：普通荧光显微镜汞灯需要预热，达到稳定后使用，图像采集过程中保证对焦清晰，背景尽量是黑色，最好不要过曝，荧光容易猝灭，宜尽快采集图像。

图像处理; 采集图像后，我们会将DAPI和目的荧光的图像Merge在一起。当然，有的还会计数或者分析荧光强度，可以用ImageJ软件进行。

至于免疫荧光，其他操作基本相同，常用的也是4%多聚甲醛对细胞进行固定10-15min，用PBS进行漂洗两到三次。0.25%的Triton X-100对细胞进行通透10min，但接下来用3%左右的BSA室温半小时对多余位点进行封闭是普通荧光染色没有的。随后就是孵育一抗，室温1-2h或者4℃过夜，PBS洗涤，孵育带荧光的二抗，PBS洗涤，封片（抗荧光猝灭剂）。