绵羊痘病毒探针法荧光定量PCR试剂盒 返回列表页

PCR特异性：
1.primers design
这是重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其它序列退火的primer要符合下面一些条件：
1)足够长，18～24bp，以保证特异性，当然，不是说越长越好，太长的primer同样会降低特异性，并且降低产量；
2)GC%，40%~60%；
3)5'端和中间序列要多GC，以增加稳定性；
4)避免3'端GCrich，个BASE不要有GC，或者5个有3个不要是GC。
5)避免3'端的互补，否则，容易造成DIMER；
6)避免3'端的错配；
7)避免内部形成二级结构；
8)附加序列(RT site，Promoter sequence)加到5'端，在算Tm值时不算，但在检测互补和二级结构要加上它们；
9)使用兼并primer时，要参考密码子使用表，注意：生物偏好性，不要在3'端使用兼并primer，并使用较高的primer浓度(1μM～3μM)；
10)学会使用一种design software，PP5，Oligo6，DNA star，Vector NTI，Online design et al。

产品名称：绵羊痘病毒探针法荧光定量PCR试剂盒
英文名称：Sheeppox Virus(SPPV)
货号：XG01P4085
分类：荧光定量PCR试剂盒
储存条件：-20℃避光保存，避免反复冻融。
运输：低温、避光，快递免费送货上门。

荧光定量PCR实验步骤：
①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其*溶解。
②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的lvfang，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚lvfang相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其*溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。
实时定量PCR：
①β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3μl按10倍稀释（加水27μl并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。
②反应体系如下：
标准品反应体系
序号  反应物  剂量
1   SYBR Green 1 染料  10μl
2  阳性模板上游引物F  0.5μl
3  阳性模板下游引物R  0.5μl
4  dNTP  0.5μl
5  Taq酶  1μl
6  阳性模板DNA  5μl
7  ddH2O  32.5μl
8  总体积  50μl
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

大鼠淋巴成纤维细胞*培养基费氏中华根瘤菌 Sinorhizobium fredii

刺孢吸水链霉菌昆变种 Streptomyces hygrospinocus酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae

苜蓿中华根瘤菌黄芪黄酮

Hela S3(人宫颈细胞)小鼠皮层神经胶质细胞（EGFP标记）

大豆慢生根瘤菌 Bradyrhizobium japonicumJeKo-1(人套细胞淋巴瘤细胞)

铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa酸球菌亚种 Lactococcus lactis subsp. lactis

大鼠肾上腺嗜鉻细胞瘤细胞（高分化）中慢生华癸根瘤菌 Mesorhizobium huakuii

人宫内膜腺细胞柠檬串珠菌 Leuconostoc citreum

热带假丝酵母 Candida tropicalis费氏中华根瘤菌 Sinorhizobium fredii

嗜热链球菌 Streptococcus thermophilus酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae

CNE1, 人鼻咽细胞系人成巨核细胞白血病细胞

酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae人骨髓间充质干细胞（hMSCs）

豇豆慢生根瘤菌 Bradyrhizobium vigna淡紫拟青霉 Paecilomyces lilacinus
绵羊痘病毒探针法荧光定量PCR试剂盒小鼠膀胱平滑肌细胞*培养基Cytomegaoviyns IgM antibody*96T

小鼠动脉内皮细胞*培养基Brain derived neurotrophic facor上海直销96T

小鼠动脉平滑肌细胞*培养基specific IgE4 against dust mite antibody*96T

小鼠小管上皮细胞*培养基His-Tag rabbit polyclonal现货供应96T

小鼠小球内皮细胞*培养基lupus anticoagulation*96T

小鼠前列腺上皮细胞*培养基specific IgG4 against dust mite antibody上海直销96T

小鼠上皮细胞*培养基Ca-Mg-ATPase*96T

小鼠膀胱成纤维细胞*培养基uric acid transporter 1现货供应96T

小鼠足突细胞*培养基short-chain fatty acids*96T

小鼠小管平滑肌细胞*培养基Medroxyprogesterone 17-acetate上海直销96T

基因反应体系：
序号  反应物  剂量
1  SYBR Green 1 染料  10μl
2  内参照上游引物F  0.5μl
3  内参照下游引物R  0.5μl
4  dNTP  0.5μl
5  Taq酶  1μl
6  待测样品cDNA  5μl
7  ddH2O  32.5μl
8  总体积  50μl
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃　2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。