吕氏泰勒虫探针法荧光定量PCR试剂盒 返回列表页

客户只需提供样品和待检测基因名称即可。由我们提取RNA，设计并合成引物，完成荧光定量PCR实验以及后续数据分析，提供实验报告给您。

产品特点:
灵敏度高：可检测个位拷贝数的基因
特异性高：有效避免非特异性扩增的出现
稳定性高：复孔间差异小，实验结果重复性强
扩增性能优：扩增效率高，荧光信号强

样品RNA的抽提：
①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其*溶解。
②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其*溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2 RNA质量检测
1）紫外吸收法测定
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。
① 浓度测定
A260下读值为1表示40 ?g RNA/ml。样品RNA浓度(?g/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 ?g/ml。

具体计算如下：
RNA溶于40 ?l DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495?l的TE中，测得A260 = 0.21
RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 ?g/ml = 840 ?g/ml 或 0.84 ?g/?l
取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 ?l，剩余RNA总量为：35 ?l × 0.84 ?g/?l = 29.4 ?g
②纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
2）变性琼脂糖凝胶电泳测定
①制胶
1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% (12.3 M)。10×MOPS电泳缓冲液
浓度  成分
0.4M  MOPS，pH 7.0
0.1M  乙酸钠
01M  EDTA
灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 ?l溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
②准备RNA样品
取3?gRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10?g/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
③电泳
上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5-6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。
④紫外透射光下观察并拍照
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。
样品cDNA合成:
①反应体系
序号  反应物  剂量
1  逆转录buffer  2μl
2  上游引物  0.2μl
3  下游引物  0.2μl
4 dNTP  0.1μl
5  逆转录酶MMLV  0.5μl
6  DEPC水  5μl
7  RNA模版  2μl
8  总体积  10μl
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
②混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。
③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。

金横裂链霉菌 Streptomyces aureosegmentosus酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae

豇豆慢生根瘤菌 Bradyrhizobium vigna中慢生华癸根瘤菌 Mesorhizobium huakuii

粟酒裂殖酵母 Schizosaccharomyces pombe绿色木霉 Trichoderma viride

J82(人膀胱细胞)青铜小单胞菌 Micromonospora chalcea

嗜热脂肪地芽孢杆菌 Geobacillus stearothermophilus酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae

大豆慢生根瘤菌 Bradyrhizobium japonicumMEF, 小鼠胚胎成纤维细胞

皱褶假丝酵母 Candida rugosa人脐动脉内皮细胞

豇豆慢生根瘤菌 Bradyrhizobium vigna近平滑假丝酵母 Candida parapsilosis

苜蓿中华根瘤菌 Sinorhizobium meliloti泡盛曲霉 Aspergillus awamori

苏云金芽胞杆菌托马诺夫亚种 Bacillus thuringiensis subsp. toumanoffii纤维素链霉菌 Streptomyces cellulose

粟酒裂殖酵母 Schizosaccharomyces pombe奇异变形杆菌 Proteus mirabilis

SW626(人卵巢细胞)巨大芽胞杆菌 Bacillus megaterium

嗜热脂肪地芽孢杆菌 Geobacillus stearothermophilus酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae
吕氏泰勒虫探针法荧光定量PCR试剂盒顺-双(三苯基膦)铂(II), Pt min

烯丙基三苯基溴化

烯丙基三苯基溴化

钠三水合物

钠三水合物

顺-(苯甲腈)铂(II)

2-羟基乙基磺钠

2-羟基乙基磺钠

2-羟基乙基磺钠

[1,3-双(苯基膦)丙烷]化镍(II)

注意事项:
1. 建议使用新鲜采取的动物组织，若为冷冻组织，应尽量避免反复冻融，否则会导致模板的降解，影响PCR效率。

2. 试剂Buffer AL若低温保存，易产生沉淀。在使用前务必将其在室温中放置一段时间，也可在37℃水浴中预热10 min，以溶解沉淀，混匀后再使用。
3. 电泳检测时，切勿使用含有SDS的Loading Buffer。否则，电泳时会在泳道中出现一大团拖尾亮带，影响实验结果。
4. 建议扩增片段长度1 kb以内，以便扩增效率佳。
5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。