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热敏双链DNA特异性核酸酶(HL dsDNase)

热 敏 双 链 DNA 特 异 性 核 酸 酶 (Heat labileds-DNA-specific Nuclease ，又名 ezDNase 或 HLdsDNase)，为双链特异性核酸酶。其特异性的识别降解双链 DNA，对单链 DNA 或 RNA 几乎无活性，其降解 dsDNA的能力比 ssDNA 高~5000 倍。除此外，该酶降解双链 DNA的能力比 bovine DNaseI 高~30 倍，因此特别适用于去除RNA 样品中的基因组 DNA 污染。该热敏型双链 DNA 核酸酶可将 DNA 降解为 2~8bp 的产物，且 55℃ 5min 可使该酶不可逆失活，同时又能保持 RNA 和 ssDNA 的稳定性。除此外，本酶适合于，对基因组样品进行酶法片段化反应。

储存：-20℃ 可保存 3 年。
活性定义： 1 单位指 25°C 条件下 15min 将 10μg 基因组DNA 消化至 80%的产物<500bp，所需的酶量。
使用注意事项
（1）1×dsDNase Buffer：20mM Tris-HCl pH8, 5mM MgCl2。该酶需要 1~5mM MgCl2。
（2）该酶对 K+敏感，反应体系中推荐 K+浓度低于 40mM。
（3）通常在 RT 反应中的用量为 0.1~0.5U/20 μl 体系。
（4）任何浓度的 SDS、盐酸胍均抑制该酶活性。
（5）该酶的反应温度为 25~37℃，42℃ 30min 后活性损失 70%。
使用实例 1（对基因组 DNA 进行片段化反应）
1. 按以下组分配制反应体系
基因组 DNA 10 μg
10×dsDNase Buffer 2.5 μl
HL dsDNase (2 U/μl) 0.5-1 μl
Rnase Free H2O Up to 25 μl
2. 室温 25°C 孵育 15min，55~65°C 5min 加热失活。
使用实例 2（基因组 DNA 的去除）
1. 按以下组分配制反应体系
基因组 DNA 1 μg
10×dsDNase Buffer 2.5 μl
HL dsDNase (2 U/μl) 1 μl
Rnase Free H2O Up to 25 μl
2. 室温 25°C 孵育 30min，55~65°C 5min 加热失活。此时
基因组 DNA，通常 90%以上的产物被消化至<15bp

一、模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成         等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；

五、PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；

六、酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。

七、MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。

八、DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；

①Oligo dT
选择Oligo dT时，要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
②随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5µg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5µg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（＜500bp）的增加和长片段、全长产物的降低。
③特异性引物
基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。而且不同引物退火温度本来就不相同，所以一般不推荐使用。如需要使用特异性引物，建议对退火温度进行优化。