亚硝酸还原酶（NiR ）试剂盒说明书

      规格：100管/48样

亚硝酸还原酶（Nitrite reductase，NiR ）试剂盒说明书

微量法

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

硝酸还原酶（NiR）是一类能催化亚硝酸盐还原的酶，广泛存在于微生物及植物体内，是自然界氮循环过程中的关键酶，可以将亚硝酸盐降解为NO或NH3，从而减少环境中亚硝态氮的积累，降低因亚硝酸盐累积而造成的对生物体的毒害作用。

测定原理

亚硝酸还原酶可将NO₂^-还原为NO，使样品中参与重氮化反应生成紫红色化合物的NO₂^-减少，即 540nm处吸光值的变化可反应土壤中亚硝酸还原酶的活性。

需自备的仪器和用品

天平、研钵、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、水浴锅、低温离心机。

试剂的组成和配制

试剂一：液体 112mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 1.5mL×1 支，4℃保存。

试剂三：液体 1mL×1 支，4℃保存。

试剂四：粉剂×1 支，4℃避光保存。临用前加0.6mL蒸馏水充分溶解。

试剂五：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加3.2mL蒸馏水充分溶解。

显色剂 A：液体 2 mL×1 瓶，4℃避光保存。

显色剂 B：液体 2mL×1 瓶，4℃避光保存。

临用前，根据用量将显色剂A和显色剂B按1:1的比例混合。

酶液提取

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2．细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。

测定操作表

注意：空白管只需测定一次。

计算公式

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y=0.0136x-0.005，R²=0.9981

1．按照蛋白含量计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每小时还原1μmol NO₂ˉ的量为一个酶活力单位。

NiR（μmol/h/mg prot）=[A空白管-(A测定管-A对照管)+0.005]÷0.0136×V反总÷（V样×Cpr）÷T=490.2×（A 空白管-A 测定管+A 对照管+0.005）÷Cpr

2. 按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每小时还原1μmol NO₂ˉ的量为一个酶活力单位。

NiR（μmol/h/g）=[A 空白管-(A 测定管-A 对照管)+0.005]÷0.0136×V 反总÷（W×V 样÷V 样总）÷T= 490.2×（A 空白管-A 测定管+A 对照管+0.005）÷W

3. 按照细胞数量计算

酶活单位定义：每10⁴个细胞每小时还原1μmol NO₂ˉ的量为一个酶活力单位。

NiR（μmol/h/10⁴cell）=[A 空白管-(A 测定管-A 对照管)+0.005]÷0.0136×V 反总÷（细胞数量×V样÷V 样总）÷T=490.2×（A 空白管-A 测定管+A 对照管+0.005）÷ 细胞数量

V 反总：反应体系总体积，0.2mL；V 样：体系中加入样本体积，0.03mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1h； Cpr：样本蛋白含量；W：样本质量，g

b. 使用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y =0.0068x-0.005，R²=0.9981

1．按照蛋白含量计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每小时还原1μmol NO₂ˉ的量为一个酶活力单位。

NiR（μmol/h/mg prot）= [A 空白管-(A 测定管-A 对照管)+0.005]÷0.0068×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T= 980.4×（A 空白管-A 测定管+A 对照管+0.005）÷Cpr

2. 按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每小时还原1μmol NO₂ˉ的量为一个酶活力单位。

NiR（μmol/h/g）= [A 空白管-(A 测定管-A 对照管)+0.005]÷0.0068×V 反总÷（W×V 样÷V 样总）÷T= 980.4×（A 空白管-A 测定管+A 对照管+0.005）÷W

3. 按照细胞数量计算

酶活单位定义：每10⁴个细胞每小时还原1μmol NO₂ˉ的量为一个酶活力单位。

NiR（μmol/h/10⁴cell）= [A空白管-(A测定管-A对照管)+0.005]÷0.0068×V 反总÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T= 980.4×（A空白管-A测定管+A 对照管+0.005）÷ 细胞数量

V 反总：反应体系总体积，0.2mL；V 样：体系中加入样本体积，0.03mL；V 样总：加入提

取液体积，1mL；T：反应时间，1h； Cpr：样本蛋白含量；W：样本质量，g

注意事项

配制好的试剂三、试剂四3天内使用完。