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ELISA,酶联免疫法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)是将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法,利用抗原抗体的特异性反应,对样本中可溶性目的产物进行定量检测。
ELISA样本制备简单;灵敏度高;特异性强;重复性好;操作简单;检测仪器易获得。
ELISA(酶联免疫吸附) | IHC(免疫组化) | Western bolt (蛋白质印迹法) |
---|---|---|
定性 | 定性 | 定性(一般不用) |
多用于定量分析 | 半定量 | 定量 |
非定位 | 定位(优势) | 半定位 |
灵敏度高 | 灵敏度中高 | 灵敏度高 |
血清、血浆、尿液、细胞或组织培养上清液 | 组织、细胞切片 | 组织/细胞匀浆 |
分泌蛋白/细胞因子 | 胞内蛋白/膜蛋白 | 对指标定位没有要求 |
常见ELISA种类
一、直接ELISA
原理:将抗原与固相载体连接,洗涤除去未结合的抗原及杂质。加酶标抗体进行孵育。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。CHED I洗涤未结合的酶标抗体。此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。加底物反应。直接法主要用于测定抗原。
二、间接法ELISA
原理:将抗原与固相载体相连结,形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。加入特异性一抗与固相抗原相结合,形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后,加酶标二抗。固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合,从而间接地标记上酶。洗涤后,加底物显色。
三、双抗夹心法ELISA
原理:双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子,但不适用于小分子抗原。将特异性抗体(捕获抗体)与固相载体连接,形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。加入待检样品,保温孵育。样品中的特异性抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。加酶标抗体(检测抗体)保温孵育。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。CHEDI洗涤未结合的酶标抗体。加底物反应。
双抗原夹心法测抗体的反应模式与测抗原相似,用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体。
四、竞争法ELISA
原理:竞争法ELISA最为复杂,通常用于检测小分子如半抗原、激素、药物等。样品中待检游离抗原与固定于固相载体上的抗原一起竞争相同的有XIANLIANG抗体,当样品中的游离抗原越多,就可结合越多的抗体,而固相抗原只能结合较少的抗体。反之亦然。经洗涤去除样品中的抗原与抗体的结合物,只留下固相抗原与抗体的结合物。显示经计算可得样品中抗原的含量。竞争法可根据实验设置直接法、间接法或夹心法形式。
不同 ELISA 检测方法比较
方法 | 应用范围 | 优势 | 缺点 | 备注 |
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双抗体夹心法 | 检测抗原常用的方法,用于检测大分子 | 灵敏度高、特异性强、抗原无需事先纯化 | 检测物需要拥有两个以上不同的抗原表位或多个相同的重复表位 | 不能用于小分子检测 |
直接法 | 检测抗体最常见的方法,对于病原体抗体检测和诊断 | 操作简便、无需二抗、避免交叉反应 | 实验中的一抗需要直接用酶标记,成本相对较高。 | 一抗特异性非常重要 |
间接法 | 同上 | 二抗可以加强信号 | 交叉反映几率高 | 抗原纯度重要 |
竞争法 | 适用于检测特异性抗体、抗原中有不易去除的干扰物 | 高效、快速 | 整体的敏感性和专一性较差 | 适用于小分子、半抗原检测,如Cortisol等 |
ELISA应用场景
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