原理
材料与仪器
尿样
睾酮 表睾酮 雄酮 苯胆烷醇酮 DHEA 内标甲基睾酮标准品 甲醇 甲酸 乙酸铵 磷酸缓冲液 β-葡萄糖醛酸甙酶Et2 O
三重四极杆串联质谱仪 液相色谱系统 恒温水浴锅
步骤
1.样品收集
2.样品处理
取尿液210 mL于试管中，加入5 ng甲基睾酮(内标)及210 mL pH6.8的磷酸缓冲液、150 μL β-葡萄糖醛酸甙酶(3 000 U)，于80℃恒温水浴中培养3 h，取出后冷却至室温。再加入3.5 mLEt2 O，混旋，离心，取出有机相并于60℃水浴中挥干，残渣中加入100 μL 流动相溶解，供LC-MS/MS分析。
3.色谱及质谱条件
串联质谱：采用电喷雾电离源( ES I) ，在多反应监测(MRM )正离子模式下扫描。碰撞气(CAD )压力为48 263 Pa；气帘气(CUR)压力为68 948 Pa；雾化气(GS1)压力为241 317 Pa；辅助加热气(GS2)压力为275 790 Pa。喷雾电压为5 500 V；离子化温度( TEM )为500 ℃。
选取各目标物的两组特征母离子 /子离子对 ,分别优选其最佳碰撞电压 (CE)和去簇电压 (D P ) 。并采用丰度较强的一组母离子 /子离子对进行定量分析。
注意事项
1. 液相色谱分离条件的优化是本研究的关键。睾酮与表睾酮、雄酮与苯胆烷醇酮均为同分异构体 ,具有相同的母离子和子离子 ,必须依靠色谱方法进行分离。
2. 每个目标物选取低、中、高 3种浓度的样品 ,以3种浓度样品与对应标准溶液测定结果相比求得回收率 ,并考察方法的精密度、准确度。
