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细菌膜蛋白质微量提取试剂盒使用方法

阅读:204      发布时间:2022-8-23
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细菌膜蛋白质微量提取试剂盒使用方法


准备:第一次使用本试剂盒时需要将所有 DNase I 干粉倒入溶液 B 中,轻柔颠倒 使 DNase 干粉溶解。未用完的部分需要放-20℃保存,最好在一个月内完,否则 DNase 将逐渐失去活性。此外,最好在实验前 1 小时将溶液 B 冰浴预冷。 


用法一:小量制备(主要用于上样量比较小的 SDS-PAGE 电泳等实验)


1、 收集 20-40 mL 过夜培养的细菌饱和培养液(OD420 在 1.5 左右即可),2500 g 室温离心 10 分钟后弃上清。


2、 加入 2 mL 溶液 A,轻柔吹打,将细菌重悬于溶液 A 中。


3、 2500 g 室温离心 10 分钟后弃上清。 4、 加入 0.5 mL 溶液 B(必须已经提前加入了 DNase I 干粉),轻柔吹打使细菌 重悬。注:如果细菌起始量没有 20-40 mL,溶液 A 的用量可以等比例降低。 重悬在溶液 A 中的细菌可以放-80℃长期保存。 


5、 用超声或 French Press 方法裂解细胞。如果用 French Press 方法,则需要 处理至少两次,每次的压力为 9.65×10E7(=14000 psi)。注意:不论用哪 种裂解方法,都必须在显微镜下检查细菌是否已经裂解,否则还需要重复细菌 裂解过程,直到 80%以上的细菌都裂解为止。


6、 2500g 室温离心 8 分钟后小心转移上清到新的 10 mL-15 mL 塑料离心管中 (如 Beckman Optima 台式超速离心机离心管),弃沉淀(未破裂细胞)。


7、 在上清(细菌裂解液)中加入 5 mL 预冷的溶液 C,轻柔颠倒混匀后冰浴放置 30-60 分钟。其间可以轻柔颠倒混匀 3-5 次。


8、 用 Bechman Optima 台式超速离心机 115,000g 4℃离心 60 分钟。也可以 使用其他冷冻超速离心机,但离心力应该一致,否则有可能得不到沉淀。


9、 小心移弃上清,在沉淀中加入 0.2 mL 溶液 A,充分吹打混匀。


10、用 Beckman Optima 台式超速离心机 115,000g 4℃离心 60 分钟。也可 以使用其他冷冻超速离心机,但离心力应该一致,否则有可能得不到沉淀。 11、小心移弃上清,所得沉淀放-20℃长期保存,也可以直接加入 0.1 mL 自备的, 跟后续实验兼容的缓冲液(如 1×SDS-PAGE 上样液中,可从本公司购买), 所得膜蛋白的浓度将在 1mg/mL 左右。


用法二:大量制备(主要用于上样量比较大的 2D 电泳等实验) 


1、 收集 200-400 mL 过夜培养的细菌饱和培养液(OD420 在 1.5 左右即可),2500 g 室温离心 10 分钟后弃上清。


2、 加入 20 mL 溶液 A,轻柔吹打,将细菌重悬于溶液 A 中。


3、 2500 g 室温离心 10 分钟后弃上清。


4、 加入 5 mL 溶液 B(必须已经提前加入了 DNase I 干粉),轻柔吹打使细菌重悬。注:如果细菌起始量没有 200-400 mL,溶液 A 的用量可以等比例降低。重悬在溶液 A 中的细菌可以放-80℃长期保存。


5、 用超声或 French Press 方法裂解细胞。如果用 French Press 方法,则需要处理至少两次,每次的压力为 9.65×10E7(=14000 psi)。注意:不论用哪种裂解方法,都必须在显微镜下检查细菌是否已经裂解,否则还需要重复细菌裂解过程,直到 80%以上的细菌都裂解为止。


6、 2500g 室温离心 8 分钟后小心转移上清到干净的玻璃烧杯中,弃沉淀(未破裂细胞)。


7、 在上清(细菌裂解液)中加入 50 mL 预冷的溶液 C,轻轻在冰浴中搅拌混匀30-60 分钟。注:可以在大烧杯中装冰,然后将装有样品的小烧杯放入,在放入干净的搅拌子,以zui低速度搅拌。


8、 用 Beckman Type 55.2 Ti 转头 115,000g 4℃离心 60 分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机,但离心力应该一致。


9、 小心移弃上清,在沉淀中加入 2 mL 溶液 A,充分吹打混匀。


10、用 Beckman Type 55.2 Ti 转头 115,000g 4℃离心 60 分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机,但离心力应该一致。


11、小心移弃上清,所得沉淀放-20℃长期保存或溶解在 1 mL 自备的,跟后续实验兼容的缓冲液(如 1×等电点电泳上样液,可从本公司购买),所得膜蛋白的浓度在 1mg/mL 左右。


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