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MTT检测试剂盒

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更新时间:2022-06-20 16:45:33浏览次数:141次

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品牌 其他品牌 货号 LZ-01X6322
MTT检测试剂盒公司正在出售的产品:人α1微球蛋白/bikunin前体(AMBP)ELISA试剂盒人ELISA试剂盒96T/48T人α2巨球蛋白(α2-MG)ELISA试剂盒人ELISA试剂盒96T/48T人α2抗纤溶酶(α2-AP)ELISA试剂盒 人ELISA试剂盒96T/48T人α2纤溶酶抑制物(α2-PI)ELISA试剂盒人ELISA试剂盒96T/48T

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公司产品仅供科研使用,下列是产品属性:

产品名称英文名称规格货号
MTT检测试剂盒MTT Assay Kit500次LZ-01X6322

商品介绍:
MTT广泛用于检测细胞生长,其原理是MTT可以被活细胞线粒体内的脱氢酶还原生成深紫色的formazan结晶,而死细胞则无此活性。深紫色的formazan结晶被溶解后可以通过测定490nm波长的光吸收而测定出其浓度,并由此推测出细胞的活力,细胞增殖越旺盛,则吸光度越高;细胞毒性越大,则吸光度越低。
产品特点:
1.采用*的Formazan溶解液,可以充分溶解formazan,减少误差。
2.背景低,灵敏度高,线性范围宽,重复性好。
3.本产品为足够500次(5个96孔细胞培养板)微孔板检测。
4.可用于生物活性因子活性检测、抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性测定等。

存条件:低温运输、-20℃保存(但溶液B也可以常温运输和保存),有效期一年。
使用方法:
下面操作是检测细胞毒性的试验,其他应用跟此类似或更简单(如生长曲线试验),操作步骤可以以此为基础稍作修改即可,故不再赘述。
㈠、接种细胞
1.按常规消化法消化汇合的单层细胞,收集到含血清的培养基中。
2.200g离心5分钟收集细胞沉淀。
3.用培养基重悬细胞沉淀,制备成单细胞悬浮液并计数。
4.将细胞稀释到2.5×103个/mL~5×10个/mL之间(需要根据细胞的生长速度决定),如果不知道生长数度,一般可以稀释到1×10个/mL。
5.将足够量的细胞悬液转移到培养皿中(便于用排枪取样)。一个96孔板的MTT检测需要约20mL的细胞悬液。
6.用排枪在96孔板除的第2-11列各孔正中央加入200μL细胞悬液(对正常细胞)。如果是肿瘤细胞,则加入100μL肿瘤细胞悬液和100μL培养基(总体积为200μL)。注意:一定要把细胞加在孔的正中,否则细胞会聚集在孔的角落处,影响试验。
7.用排枪在96孔板除的第1和第12各孔中加入跟细胞悬液等体积的培养基。第1 列各孔将作为+培养基-细胞+MTT对照(用于测OD时调零),第12列加培养基的作用是减少边缘效应对第11 列反应的影响。
8.按常规细胞培养方法在37℃和5% CO2条件下孵育1-3天,使细胞进入指数生长期。
㈡、药物处理
9.用培养基将药物稀释到8个待测浓度(如果不知道待测浓度,则需要预试验确定),一般一种药物需要做3块平行板。
10.去除第2到第11列(共10列)各孔中的培养基(不要触动细胞),保留第1 列和第12列各孔中的培养基。
11.在第2和第11列(共2列)的各孔中加入200μL新鲜培养基,这些孔将作为+培养基+细胞-药物的对照。
12.在第3到第10列(共8列)各孔中加入8个浓度梯度的待测药物,每列加入一个浓度的药物。
13.按常规方法把96孔板继续放在在37℃和5% CO2条件下孵育一定的时间,此段时间即为药物处理细胞的时间,由用户自己决定。
14.处理结束后去除第2 到第11列(共10列,均含细胞)所有孔中的培养基,并再加入100μL新鲜培养基。
15.每天换培养使细胞数量扩增2-3倍(所需时间随细胞不同而不同)。
㈢、存活细胞计数
16.在生长末期,去除第1到第11列各孔中的培养基后,再加入100μL新鲜培养基和10μL溶液A(含MTT成分),用锡箔包裹住96孔板后放在37℃和5% CO2条件下继续培养4-8小时。注意:溶液A在低温情况下会凝固,使用前请室温放置或20-25℃水浴至全部溶解,摇匀后使用。MTT有致癌性,一定要带手套操作。
17.小心吸弃孔内培养基(含溶液A)。由于培养基可能会影响光吸收,最好尽可能去除。
18.每孔加入100μL溶液B,置摇床上低速振荡10分钟,使MTT形成的formazan结晶物充分溶解。
19.由于产物不稳定,故需要立即在酶联免疫检测仪上选择490nm测定吸光度。
 注意:用第1 列各孔(+培养基-细胞+MTT对照)调零。
20.计数同样处理的各次重复的平均值。
21.以药物浓度为横轴,以吸光度为纵轴绘制曲线。由于各处理吸光度绝对值差别很大,一般需将其转化成生长抑制率(以不加药物的第2和第11列各孔数据的平均数作为100%),这样便于计算出IC50,用于各种药物处理效果的比较。注意:如果测生长曲线,则以时间为横轴。正常生长曲线一般呈现S型,具有促进作用的则斜率加大。

注意事项:
①加入试剂的顺序应一致,以保证所有反应板孔温育的时间一样。
②使用干净的塑料容器配置洗涤液。
③按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
④底物A应挥发,避免长时间打开盖子。底物B对光敏感,避免长时间暴露于光下。避免用手接触,有毒。实验完成后应立即读取OD值。
⑤洗涤酶标板时应充分拍干,不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。
⑥使用一次性的吸头以免交叉污染,吸取终止液和底物A、B液时,避免使用带金属部分的加样器。
⑦实验中不用的板条应立即放回包装袋中,密封保存,以免变质。
⑧试剂应按标签说明书储存,使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃,不可保存。
⑨不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)

人CD14分子(CDl4)ELISA试剂盒    人ELISA试剂盒    96T/48T    

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人CXC趋化因子受体3(CXCR3)ELISA试剂盒    人ELISA试剂盒    96T/48T    

人C多肽(CP) ELISA试剂盒    人ELISA试剂盒    96T/48T    

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XY-E11196    人ELISA试剂盒    96T/48T    

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人D二聚体(D2D)ELISA试剂盒    人ELISA试剂盒    96T/48T    

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人EB病毒IgG(EBv IgG)ELISA试剂盒    人ELISA试剂盒    96T/48T    

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人E钙粘着蛋白/上皮性钙黏附蛋白(E-Cad)ELISA试剂盒    人ELISA试剂盒    96T/48T    

人E选择素(E-Selectin/CD62E)ELISA试剂盒      人ELISA试剂盒    96T/48T    

人α-内肽(α-EP)ELISA试剂盒    人ELISA试剂盒    96T/48T    

人α/β干扰素受体(IFN-α/βR)ELISA试剂盒      人ELISA试剂盒    96T/48T    Caspase 9 活性检测试剂盒    

Caspase抑制剂(Z-VAD-FMK)    

Caspase 3抑制剂(Ac-DEVD-CHO)    

线粒体膜电位检测试剂盒    

罗丹明123    

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细胞增殖示踪荧光探针(CFDA SE)    

Ad-GFP-LC3B    

Ad-mCherry-GFP-LC3B    

DAPI溶液(5mg/ml)    

DAPI染色液    

Hoechst 33258细胞蓝色荧光染料    

Hoechst 33258染色液    

Hoechst 33342细胞蓝色荧光染料    

Hoechst 33342染色液    

活细胞染色液(Hoechst 33342)(100×)    

细胞活力检测试剂盒(化学发光法)    

碘化丙啶    

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Annexin V-APC细胞凋亡检测试剂盒    

Annexin V-APC/7-AAD双染细胞凋亡检测试剂盒    

操作程序:

注意:最重要的是及时固定,并在固定液中加入0.1%的DEPC处理,以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外,过度固定对原位杂交有明显的不利影响。

1.玻片的处理:一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。

2.细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养,条件为37℃和5%的CO2,所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。

3.培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定:固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6),含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤,干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。

4.30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合,室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。

5.暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型,混匀),37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。

6.后固定:消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6),含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。

7.预杂交:湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体,不洗。

8.杂交——按每张切片20μι杂交液,加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后,盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。

9.杂交后洗涤:揭掉盖玻片,37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次;37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色,重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。

10.滴加封闭液:37℃30分钟。甩去多余液体,不洗

11.滴加化鼠抗*:37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。

12.滴加SABC:37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。

13.滴加化过氧化物酶:37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。

14.DAB显色:使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂A,B,C各一滴,混匀,加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。

15.必要时苏木素复染,充分水洗。

16.酒精脱水,二甲苯透明,封片。


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