禽呼肠孤病毒抗体检测试剂盒（酶联免疫法） 使用说明书.

通用名：禽呼肠孤病毒抗体检测试剂盒（酶联免疫法）

英文名：Test Kit for Antibodies to Avian reovirus,ARV (ELISA)

【包装规格】 96T×1/盒

【预期用途】禽呼肠孤病毒是由呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)引起鸡多种疾病，包括病毒性关节炎、矮小综合征、呼吸道疾病、肠道疾病和所谓吸收不良综合征，是一种传染性疾病。本病呈世界性分布，是严重危害养禽业的最主要疫病之一。疫苗免疫是预防和控制禽呼肠孤病毒发生的*途径，而免疫后抗体水平的高低反映实际的疫苗免疫效果，直接关系到免疫鸡群对禽呼肠孤病毒的抵抗力。

    本试剂盒适用于：鸡血清抗体的检测，以确定被检鸡是否感染禽呼肠孤病毒或免疫鸡体内抗体水平；评估鸡群感染ARV的风险程度，为ARV免疫程序的制定提供参考。

【原理】

本试剂盒由预包被禽呼肠孤病毒重组蛋白的酶标板、酶标记物及其他配套试剂组成，应用间接酶联免疫法（ELISA）原理检测鸡血清或血浆中鸡传染性喉气管炎病毒抗体。实验时，在酶标板中加入对照血清和待检血清，再加入HRP标记的检测抗体，经温育后，若样品中含有禽呼肠孤病毒的抗体，则将与酶标板上抗原抗体结合，经*洗涤除去未结合的抗体和其他成分后；在孔中加底物液TMB，与酶标结合物反应形成蓝色产物，显色深浅与样品中的特异性抗体含量成正相关；加入终止液终止反应后，产物变为黄色；用酶标仪在450nm波长测定各反应孔中的吸光值，即可知样品是否含有禽呼肠孤病毒抗体。

【试剂盒组成】

【储存及有效期】 2～8℃保存，有效期6个月。

包被板开封后请于2～8℃避光保存，避免受潮。使用期限为2个月。

【适用仪器】 含450nm、630nm波长的酶标仪，37℃恒温设备，可调微量移液器。

【样品准备】

1.取动物全血按常规方法制备血清，要求血清清亮，无溶血、无污染。样品1周内可于2～8℃保存，长期需置-20℃保存。

2. 20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水.

【检验方法】

1.使用前将试剂盒置室温30分钟，恢复至室温。

2.取所需用量酶标板条，设空白对照1孔、阴性/阳性对照各2孔，未用的板条尽快密封，2～8℃保存。

3.阴性、阳性对照孔分别加入阴、阳性对照50μl；样品孔每孔加入待测样本50μL，空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，静置，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.甩去孔内液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔依次加底物液A、底物液B各50μL，盖好盖板膜，置37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，于450nm波长处测定各孔吸光值（A值），无参比波长用空白孔调零(即所有孔吸光值减去空白孔吸光值)。

【参考值】 实验正常的情况下，阴性对照≤0.2，阳性对照≥0.8。

【检验结果的解释】

1.C.O（临界值）=0.25+阴性对照孔均值。

2.阳性判断（Cut-Off值）：阴性对照OD值+0.25，样本OD值大于阈值，判定为阳性，反之，为阴性。。

【试验方法的局限性】

该试验仅作为定性检测鸡血清或血浆中禽呼肠孤病毒抗体，根据A值高低可作抗体水平强、中、弱的粗略评估。

【注意事项】

1.实验操作时需戴手套、穿工作衣，严格健全和执行消毒隔离制度，各种实验废弃物都应按传染物处理。

2.终止液具有腐蚀性，应避免接触皮肤和衣物，如不慎接触请立即用大量自来水冲洗。

3.底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

4.酶标板从冷藏环境中取出时应恢复至室温方可开袋，以防水滴凝聚在冷板条上。未用完酶标板需放入有干燥剂的密封袋中保存。

5.洗板不正确可以导致不准确的结果，在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

6.洗涤时各孔均需加满液体，防止孔口有游离酶不能洗净，消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

7.用于检测的样品应保持新鲜。

8.试验结果的判定必须以酶标仪读数为准。

9.不同批号试剂组分不得混用。