百萤小课堂之-钙黄绿素系列产品相关问答

钙黄绿素是一种钙依赖型荧光分子。它主要用于研究体内条件下的骨代谢，并有助于在 体外条件下对凹陷区域进行染色。钙黄绿素被用于钙的荧光测定以及钙的EDTA（乙二胺四乙酸）滴定。跟着百萤来一起探索钙黄绿素的相关问题吧！

问：什么是钙黄绿素？

答：钙黄绿素通常用乙酰氧基甲基酯（例如钙黄绿素 AM）进行修饰以促进膜通透性，并广泛用作检测活细胞的活力指示剂。 它与几种药物相关的测定有关，包括细胞毒性、氧化功能和神经毒性。

问：钙黄绿素,AM如何工作？

答：钙黄绿素 AM 是钙黄绿素的乙酰甲氧基衍生物，是一种可透过膜的荧光酯酶底物，用于测定细胞活力和膜完整性。 钙黄绿素 AM 的亲脂性使其能够自由扩散穿过细胞膜并渗透到活细胞的胞质溶胶中。 进入细胞后，非特异性细胞内酯酶会酶促去除 AM 基团，由此产生的去酯化钙黄绿素产物会被困在细胞内。 在蓝光激发下，钙黄绿素在 521 nm 处发出明亮的绿色荧光。 钙黄绿素的荧光强度与细胞酯酶的活性和样品中存在的活细胞数量成正比。

问：钙黄绿素,AM 有毒吗？

答：钙黄绿素AM的SDS表明它是一种无害物质或混合物。在生命科学和药物发现研究中，钙黄绿素AM由于其相对较低的细胞毒性，通常用于研究酶活性、细胞活力、膜完整性和长期细胞追踪。然而，对于特定的细胞系和实验条件，高浓度的钙黄绿素AM已被证明对细胞具有毒性。

问：钙黄绿素AM是荧光的吗？

答：不，钙黄绿素 AM 是一种非荧光酯酶底物。 然而，在活细胞中，钙黄绿素 AM 可以被动地穿过细胞膜并进入胞质溶胶，从而使非特异性细胞内酯酶水解来自钙黄绿素 AM 的乙酰氧基甲酯，从而产生高荧光钙黄绿素产物。 钙黄绿素分别在 501 nm 和 521 nm 处具有激发和发射峰，并在激发时产生强烈的绿色荧光。 测得的信号强度与起作用的细胞酯酶的活性和存在的活细胞数量成正比。

问：钙黄绿素AM 可以在细胞中持续多久？

答：钙黄绿素是一种疏水性化合物，可以在具有完整质膜的活细胞中保留数小时至数天，具体取决于细胞类型、细胞形态或实验条件。 在 Miles 等人于 2016 年进行的基于细胞的测定中，载有钙黄绿素 AM 的前列腺癌细胞在 0.5、2、6、12、24 和 36 小时标记处成像。 在 36 小时标记处，细胞仍然发出适度的荧光； 然而，背景荧光有所增加（见图片）。 增加的原因之一是有机阴离子转运蛋白 (OAT) 对钙黄绿素的挤压，OAT 在调节阴离子平衡方面起着关键作用。 Probenecid 是一种 OAT 抑制剂，可以添加到钙黄绿素 AM 工作溶液中，以提高去酯化钙黄绿素在细胞内的保留并减少干扰。

问：钙黄绿素AM在染色后可以固定吗？

答：不能，无论使用何种固定方法 - 醛或甲醇固定 - 用钙黄绿素 AM 染色的细胞都会失去其染色效果。 此外，钙黄绿素 AM 不能用于固定细胞，因为它们缺乏将钙黄绿素 AM 转化为钙黄绿素所需的酯酶以及保留染料所需的膜完整性。 钙黄绿素 AM 是一种荧光酯酶底物，只能用于活细胞以确定细胞活力。如需此类实验，请千万注意！

问：钙黄绿素AM能染色细菌吗？

答：钙黄绿素 AM 染色不仅适用于真核生物样品，还可用于确定细菌样品中的细胞活力。 Calcein AM 适用于检测许多活的革兰氏阴性细菌菌株，可用于微生物学研究、环境监测、药物无菌检测以及食品和植物评估技术。 与真核细胞一样，细菌在其细胞质中含有微生物酯酶，可以裂解钙黄绿素 AM 的亲脂性封闭基团并将其转化为荧光钙黄绿素。 可以使用荧光仪器测量信号，其强度与存在的活细菌数量成正比。

问：钙黄绿素是细胞渗透的吗？

答：不，钙黄绿素不具有细胞渗透性。 钙黄绿素含有四个羧酸盐基团，使化合物整体带负电荷，带电分子不能通过简单的扩散穿过细胞膜，因为电荷被磷脂双层内部的疏水尾部排斥。 为了促进渗透性，钙黄绿素标记有几个乙酰氧基甲基酯基团，例如钙黄绿素 AM，从而形成不带电的疏水化合物。 这种疏水性的增加使钙黄绿素 AM 能够自由扩散穿过完整的质膜并渗透到活细胞的胞质溶胶中。

问：如何制作钙黄绿素溶液？

答：钙黄绿素及其衍生物钙黄绿素 AM 通常以冻干固体形式提供，在装入细胞之前必须重新悬浮在溶液（通常是 DMSO）中。 要制作钙黄绿素或钙黄绿素 AM 库存溶液，请在高质量无水 DMSO 中重组染料，使浓度约为 1 mg/mL。 例如，将 50 µL DMSO 添加到 50 µg 钙黄绿素 AM 中将产生 1 mg/mL 库存溶液。

对于钙黄绿素 AM，在加载到细胞中之前，需要将库存溶液进一步稀释到水性缓冲液（例如 HBSS）中。 作为水溶液，钙黄绿素 AM 易水解，应在一天内使用。图为储备溶液的配制方案，供参考。

问：钙黄绿素AM阳性对照和阴性对照是什么？

答：阳性对照：这是在正常培养环境中生长的健康、未经处理的细胞群。 未经处理的健康细胞既含有胞内酯酶将钙黄绿素 AM 水解成荧光产物，又含有完整的质膜以保留染料。 用钙黄绿素 AM 染色阳性对照会导致细胞在蓝光下激发时发出绿色荧光。

阴性对照：这是一群死细胞，通常用乙醇或甲醛固定。 死细胞不含细胞内酯酶，因此不能将非荧光钙黄绿素 AM 底物转化为荧光钙黄绿素产物。 用钙黄绿素 AM 染色的阴性对照不会产生荧光信号。

在进行钙黄绿素 AM 细胞活力检测以对比结果的变化时，与目标样本一起进行适当的阳性和阴性对照非常重要。 所有对照都应从与目标样本相同的培养物中获得。

问：AM（乙酰氧基甲基）基团对钙黄绿素的作用是什么？

答：钙黄绿素AM中的AM酯具有两个关键功能。首先，AM酯与钙黄绿素连接时，会将钙黄绿素带负电的羧基转化为不带电荷的疏水化合物。这通过使钙黄绿素AM能够自由地穿过质膜并渗透胞质溶胶来促进细胞渗透。其次，钙黄绿素染料，虽然是AM酯形式，但是非荧光的。一旦细胞渗透到胞质溶胶中，非特异性细胞内酯酶切割出AM基团，荧光就会恢复。此外，AM酯的水解恢复了钙黄绿素的负电荷，这时染料才可以被荧光仪器所检测。

问：钙黄绿素AM能染色死细胞或坏死的细胞吗？

答：不，钙黄绿素 AM 不会染色死细胞或坏死细胞，因为它们缺乏将非荧光钙黄绿素 AM 转化为荧光钙黄绿素所必需的酶（例如，非特异性细胞内酯酶）。 由于未被细胞内酯酶切割的钙黄绿素 AM 底物是非荧光的，因此成像前不需要洗涤步骤。图示：在 Costar 黑色/透明底 96 孔板中用 Calcein UltraBlue AM（货号 21908）染色的 HeLa 细胞的荧光图像。 左图：HH 缓冲液中的活 HeLa 细胞； 右图：用冰冷甲醇固定的死细胞/坏死细胞。