百萤问答之D-荧光素使用中的常见问题

D-荧光素是流行的多功能生物发光底物。萤火虫荧光素酶/荧光素生物发光系统存在于萤火虫（Photinus pyralis）和其他几种甲虫中。荧光素酶通过二氧杂环丁酮中间体氧化ATP进行活化荧光素。萤火虫荧光素酶通过荧光素的ATP依赖性氧化产生光。来自该反应的560nm化学发光在数秒内达到峰值，当荧光素和ATP过量存在时，光输出与荧光素酶活性成比例。

问：D-荧光素钾盐溶液的稳定性如何？可保存多久？

答：1.D-荧光素钾盐易溶于水和缓冲液，溶解度可高达25mg/mL。一般使用浓度为3-15 mg/mL。

2.溶液的pH值、溶液中的氧气和保存时间对其保存过程中的稳定性非常重要。当溶液的pH<6.5（发生水解作用）或>7.5（发生消旋化作用，D型转化为L型）的情况下，D-荧光素钾盐相对不稳定。如果溶液中存在少量的氧气，将加速D-荧光素钾的降解速度。

3.D-荧光素配成溶液后，在佳的保存条件（-80°C，佳pH，无氧气）下，存在固定的降解速度：0.2%/天，因此配成溶液保存的D-荧光素应尽量在1年内使用完。

4.有水存在的情况下，主要发生消旋化作用，即D-荧光素转化成L-荧光素，有报道称L-荧光素对荧光素酶催化的酶促反应有抑制作用。

百萤生物提供高质量、高纯度的D-荧光素系列产品，欢迎选购。

问：D-荧光su钠盐和D-荧光素钾盐有什么区别？

答：D-荧光su钠盐(货号12511)的水溶性高于D-荧光素钾盐(货号12507)，钠盐可以溶解到100 mg/mL，而钾盐只能溶解到60 mg/mL。

D-荧光su钠盐的外形更颗粒状，而D-荧光素钾盐的外形更细腻。

两者在动物活体成像分析和体外生物发光检测方面的效果基本相同，但有些文献和研究者更倾向于使用钾盐。

问：D-荧光su钠盐钾盐在进行体外标记的时候，需要注意什么？

答：1.纯度和质量：使用高纯度的D-荧光su钠盐，确保染料的质量良好，避免杂质对标记结果的影响。

2.溶液配制：请按照说明书准确配制荧光su钠盐的工作溶液。注意缓冲液的选择，以确保标记过程中维持适当的pH值和离子浓度。

3.保护染料活性：D-荧光su钠盐可能对光敏感，因此在标记过程中避免长时间的强光照射，最好在低光条件下操作。另外，标记溶液最好是在避光条件下保存，避免阳光直射。

4.反应时间：确保标记反应的时间充分但不过长，以防止过度标记和非特异性结合。可以通过试验不同的反应时间找到适合的标记时间。

5.染料与目标物的比例：确定适当的荧光su钠盐与目标物（如蛋白质、细胞等）的比例，以实现最佳的标记效果。过量的染料可能会引起背景噪音，而过少的染料则可能导致信号较弱。

6.洗涤步骤：完成标记后，必须进行适当的洗涤步骤，去除未结合的荧光su钠盐和其他杂质，以减少背景干扰。

7.验证标记效果：在标记完成后，使用荧光显微镜或其他荧光成像设备验证标记效果，确保目标物正确被标记并发出荧光。

8.质量控制：在进行体外标记实验时，最好同时进行阴性对照和阳性对照实验，以确保标记的特异性和可靠性。

9.存储条件：对于已标记的样品，选择适当的存储条件，确保标记的稳定性和长期保存的可靠性。

问：能否总结一下市面现售的各种D-荧光素？它们都有什么特点？什么区别？

答：目前市面常见的D-荧光素的形式有：钾盐、钠盐、游离酸、甲酯、乙酯、半乳糖苷等，下面将分别介绍它们之间的区别，供参考。

1. D-荧光su钠盐和钾盐，D-荧光su钠盐和钾盐的区别主要在于它们的溶解度和稳定性。D-荧光su钠盐的溶解度略高于钾盐，但是钾盐的稳定性略高于钠盐。这是因为钠离子对荧光素酶的活性有一定的抑制作用，而钾离子则没有。因此，如果实验条件允许，建议使用钾盐而不是钠盐。

2. D-荧光素游离酸，它在水和缓冲液中的溶解性很差，需要用弱碱如NaOH或KOH来调节pH才能溶解。而钠盐、钾盐则可以很容易地溶解在水或缓冲液中，无需额外处理。因此，钠盐、钾盐更适合体内实验，而游离酸则需要更多的注意事项。

3. D-荧光素甲酯和乙酯，首先，甲酯或乙酯需要被脂肪酶水解后，才能释放出D-荧光素。其次，两者的区别主要在于它们的水解速率和发光强度。D-荧光素甲酯的水解速率比D-荧光素乙酯快，因此它的发光峰值出现得更早，但是也持续得更短。而D-荧光素乙酯的水解速率比D-荧光素甲酯慢，因此它的发光峰值出现得更晚，但是也持续得更长。

4. D-荧光素半乳糖苷，它是一种用于检测β-半乳糖苷酶活性的荧光底物，它需要经过β-半乳糖苷酶的水解才能释放出D-荧光素。

5.  D-荧光素磷酸盐，它在6-O位置上连接了一个磷酸基，使得它不能被萤火虫荧光素酶识别。但是当磷酸基被碱性磷酸酶或蛋白磷酸酶水解后，就会释放出D-荧光素，这是一种可以被萤火虫荧光素酶催化发光的底物。因此，D-荧光素磷酸盐可以用于检测碱性磷酸酶和蛋白磷酸酶的活性。

6.  D-荧光素醋酸，它在6-O位置上连接了一个乙酸基，使得它不能被萤火虫荧光素酶识别。但是当乙酸基被酯酶水解后，就会释放出D-荧光素，这是一种可以被萤火虫荧光素酶催化发光的底物。因此，D-荧光素醋酸可以用于检测酯酶的活性。

问：D-荧光素钾盐如何标记小鼠？用量是多少？

答：1. 体外生物发光检测：用无菌纯净水对D-荧光素钾盐进行溶解，配制30mg/mL的储备溶液，分装后在-20℃避光条件下保存。在37℃恒温条件下预热处理组织培养基10-20分钟，再将处理后的培养基倒入储存液中，稀释至0.15-0.3 mg/mL的工作液浓度。之后再去除混液中的细胞培养基。等待图像分析前，向细胞内添加荧光素工作液，恒温37℃条件下孵育5-10 min，之后再进行图像分析。

2. 活体成像分析：采用无菌的DPBS缓冲液配制成为15 mg/mL的荧光素的储存液，混匀。使用水系0.2 µm真是滤器过滤对储备液进行除菌处理，处理后可即使使用，或者在-20℃避光条件下保存。腹腔注射（i.p.）：按照150 mg/kg 的荧光素/体重浓度比例进行注射；注射入体内10-15 min后（等待光信号达到Z强稳定平台期）之后，再进行成像分析。

问：D-荧光素的荧光与什么有关？它对动物有什么影响？

答：D-荧光素是萤火虫荧光素酶的化学发光底物。它在存在 ATP 的情况下通过荧光素酶氧化脱羧产生光。 D-荧光素的荧光与荧光素酶的浓度、ATP的水平、Mg2+的存在、氧气的供应和反应温度等因素有关。D-荧光素不会影响动物（没有明显毒性或免疫反应）。

问：D-荧光素钾盐可以用于测定启动子相连的荧光素酶基因的表达吗？

答：是的，D-荧光素钾盐可以用于测定启动子相连的荧光素酶基因的表达。该操作的基本步骤如下：

1. 构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。

2. 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染细胞，如HEK293T细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。

3. 加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

问：D-荧光素适合做哪些实验?

答：D-荧光素钾盐和5-氟-荧光素，作为Luciferase的作用底物，常用于以下实验：

1. 报告基因分析

2. In vivo imaging (动物活体成像)

3. In vitro imaging (细胞体外分析)

4. ATP测定

5. 其它luciferase及其基因相关的分析和研究工作

问：D-荧光素应用于活体成像的基本原理是什么？ 

答：细胞中D-荧光素酶参与的化学发光反应遵守酶促反应的基本原理，在底物D-荧光素钾过量的情况下，反应产生的光子数（发光量）与细胞中的D-荧光素酶的量成正相关，从而可以推算出细胞的数量。

问：D-荧光素钾盐溶液的稳定性是怎样的？ 

D-荧光素钾盐易溶于水和缓冲液，溶解度可高达25mg/mL。一般使用浓度为3-15 mg/mL。

溶液的pH值、溶液中的氧气和保存时间对其保存过程中的稳定性非常重要。当溶液的pH<6.5（发生水解作用）或>7.5（发生消旋化作用，D型转化为L型）的情况下，D-荧光素钾盐相对不稳定。如果溶液中存在少量的氧气，将加速D-荧光素钾的降解速度。

D-荧光素配成溶液后，在佳的保存条件（-80°C，佳pH，无氧气）下，存在固定的降解速度：0.2%/天，因此配成溶液保存的D-荧光素应尽量在1年内使用完。

有水存在的情况下，主要发生消旋化作用，即D-荧光素转化成L-荧光素，有报道称L-荧光素对荧光素酶催化的酶促反应有抑制作用。

问：D-荧光素钾盐的保存和运输条件是什么？  

保存条件：≤-20°C，避光，保持干燥。（在不打开包装的条件下，可保存两年时间）。

运输条件：高纯度的D-荧光素钾盐可在短时间内常温条件下保存，运输条件为常温。

原装（没有打开包装）荧光素的包装瓶中充有氩气，保证其稳定性，打开包装后，请严格按照保存条件保存。

D-荧光素钾盐具有易溶于水的特性，其暴露于空气中，易吸潮。在称量过程中，请考虑其易吸潮的特性，先进行温度平衡，再快速称取。