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有多种参数可用于检测细胞凋亡。这种Cell Meter 活细胞半胱天冬酶3/7活性测定试剂盒旨在通过测量活细胞中胱天蛋白酶3/7的活化来检测细胞凋亡。它用于定量凋亡细胞中活化的caspase 3/7活性，或用于筛选caspase 3/7抑制剂。TF3-DEVD-FMK，红色标记试剂，允许通过荧光显微镜，流式细胞仪或荧光酶标仪直接检测凋亡细胞中活化的半胱天冬酶3/7。该试剂盒为所有必需组分提供优化的分析方案。
适用仪器
流式细胞仪 | |
参数 | 见表1 |
荧光显微镜 | |
推荐孔板： | 黑色透明 |
通道： | 见表1 |
荧光酶标仪 | |
推荐孔板： | 黑色孔板 |
通道： | 见表2 |
表1:用于流式细胞仪和荧光显微镜的荧光强度检测
流式细胞仪 | 荧光显微镜 | |
FAM-DEVD-FMK | FL1 通道 | FITC 通道 |
Propidium Iodide | FL2 通道 | TRITC 通道 |
Hoechst Dye | 紫色激光 | DAPI 通道 |
表2:荧光酶标仪的荧光强度检测
激发 | 发射 | cutoff | |
FAM-DEVD-FMK | FL1 通道 | FITC 通道 | 515nm |
Propidium Iodide | FL2 通道 | TRITC 通道 | |
Hoechst Dye | 紫色激光 | DAPI 通道 |
实验方案
分离细胞的检测方案
概述
用测试化合物制备细胞，密度为5×105至2×106个细胞/ mL
将TF3-DEVD-FMK以1：150的比例加入细胞溶液中
在室温下孵育1小时
沉淀细胞，用缓冲液或生长培养基洗涤并重悬细胞
在Ex / Em = 550 / 595nm处分析细胞
注：使用前将所有部件在室温下解冻。
操作方法
1.根据您的特异性诱导方案，将细胞培养至适于细胞凋亡诱导的密度，但不超过2 x 106个细胞/ mL。同时，对于每种标记条件，以与诱导群体相同的密度培养非诱导的阴性对照细胞群。以下是一些诱导悬浮培养细胞凋亡的例子：
1）用2μg/ ml喜shu碱处理Jurkat细胞3小时。
2）用1μM星形孢菌素处理Jurkat细胞3小时。
3）用4μg/ ml喜shu碱处理HL-60细胞4小时。
4）用1μM星形孢菌素处理HL-60细胞4小时。
注意：应对每个细胞系进行单独评估，以确定诱导细胞凋亡的细胞密度。
2.通过向TF3-DEVD-FMK（组分A）的小瓶中加入50μLDMSO制备150X TF3-DEVD-FMK DMSO储备溶液。 将150×TF3-DEVD-FMK以1：150的比例加入细胞溶液中，并将细胞在37℃，5％CO2培养箱中孵育1小时。
注1：对于TF3-DEVD-FMK标记，细胞可以浓缩至~5×10 6个细胞/ mL。 未使用的150X TF3-DEVD-FMK DMSO储备溶液应分为单次使用的等分试样并储存在-20°C。
注2：对于粘附细胞，用0.5mM EDTA轻轻提起细胞以保持细胞完整，并在用TF3-DEVD-FMK孵育之前用含血清的培养基洗涤细胞一次。
注3：适当的孵育时间取决于所用的细胞类型和细胞浓度。 优化每个实验的孵育时间。
3.将细胞以约200g旋转5分钟，并用1mL洗涤缓冲液（组分B）洗涤细胞两次。 将细胞重悬于所需量的洗涤缓冲液中。
注1：TF3-DEVD-FMK是荧光的，因此清除任何未结合的试剂以消除背景非常重要。
注2：对于分离的细胞，应将细胞浓度调节至每个微量滴定板孔中2-5×10 5个细胞/100μL等分试样，用于步骤5。
4.如果需要，用DNA染色标记细胞（例如用于死细胞的Nuclear Green DCS1，或用于细胞核染色的整个群体的Hoechst）。
5.通过荧光显微镜，流式细胞仪或荧光酶标仪在Ex / Em = 550/595 nm处检测荧光强度（对于Nuclear Green DCS1，Ex / Em = 490/525 nm，对于Hoechst染料，Ex / Em = 350/461 nm）
5.1对于流式细胞仪，使用Ex / Em = 550/595 nm（用于Nuclear Green DCS1染色的FL1通道）的通道监测荧光强度。
5.2用于荧光显微镜和荧光酶标仪。 将100μL细胞悬浮液置于96孔黑色微量滴定板的每个孔中。
注意：如果需要平衡细胞浓度，调整诱导细胞的悬浮体积以接近非诱导细胞群的细胞密度。 如果您的细胞治疗不会导致受刺激细胞群数量的显着损失，则此调整步骤是可选的。
5.3使用TRITC通道（用于Nuclear Green DCS1染色的FITC通道，用于Hoechst染色的DAPI通道）在荧光显微镜下观察细胞。
5.4使用荧光酶标仪，使用Ex / Em = 550/595 nm（在570 nm处截止）底部读取模式监测荧光强度。
图示
图1。用 Kit # 20100荧光法检测 Jurkat 细胞中活性半胱天冬酶3/7。细胞用1μM 星形孢素处理3小时(红色) ，而未处理的细胞用作对照(蓝色)。细胞与 FAM-devD-FMK 在37 °C 温育1小时。使用FlexStation 微板阅读器使用底部读取模式在 Ex/Em = 490/525nm (在515nm 处截止)测量荧光强度(300,000个细胞/100μL/孔)。
图2。使用 FAM-devD-FMK (目录号20100)荧光法检测 Jurkat 细胞中活性半胱天冬酶3/7。用1μM 星形孢菌素处理细胞4小时(红色) ，而未处理的细胞作为对照(绿色)。对照和处理的细胞与 FAM-devD-FMK 在37 °C 温育1小时，然后在染色后洗涤一次。用 NovoCyteTM 3000流式细胞仪 FITC 通道测量荧光强度。
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