通过流式细胞术进行PBMC免疫表型分析

通过流式细胞术进行 PBMC（外周血单核细胞） 分析可广泛应用于研究和临床研究，包括 HIV 研究、癌症免疫治疗和基于细胞因子的免疫反应的基础研究。PBMCs通常通过密度梯度离心或磁珠分离从外周血、骨髓和脐带中提取。这些方法旨在将白细胞与红细胞 (RBC) 等其他细胞成分分离。

流式细胞术的一个常见应用是 PBMC 免疫表型分析。该技术测量被称为“分化簇"(CD) 标记的细胞表面分子的表达，以识别、区分和表征 PBMC 亚群。除了 CD 标记表达之外，计数和细胞大小的精确监测对于该分析也至关重要。其中一个例子是嵌合抗原受体 T (CAR-T) 细胞癌症免疫治疗领域。

为了表征 PBMC 上的 CD 标记，将针对 CD 标记的抗体与藻红蛋白 (PE) 等荧光团缀合。然后使用流式细胞仪测量荧光强度，以量化 CD 标记表达水平并区分 PBMC 亚群。本应用说明演示了用于表征 PBMC 上 CD 标记的单荧光团和双荧光团 PBMC 染色技术。

CD45 抗体和小鼠 IgG 缀合物的制备

材料：

· 1.Buccutite™ 快速 PE 抗体标记试剂盒（货号 1310）

注意：试剂盒足以进行 2 次标记反应，每个反应 100 µg 抗体

· 2.Buccutite™ 快速 APC 抗体标记试剂盒（货号 1311）

注意：试剂盒足以进行 2 次标记反应，每个反应 100 µg 抗体

· 3.1X PBS 缓冲液 (pH 7.2 – 7.4)

· 4.4 个 2 mL 洗涤管

· 5.4 个 1.5 mL 收集管

· 6.离心机

所有 CD45 抗体和小鼠 IgG 缀合物均使用以下应用说明制备：

· Buccutite™ 快速藻胆蛋白抗体偶联

CD45 抗体和小鼠 IgG 缀合物的浓度：

使用 Buccutite™ 快速藻胆蛋白抗体偶联应用说明和 Buccutite™ 快速抗体标记试剂盒（货号 1310 和 1311）制备的 CD45 和小鼠 IgG 偶联物的浓度如下：

PBMC的制备

冷冻保存的PBMC解冻并制备如下：

材料：

1.人类PBMC（冷冻保存，1000万个细胞/瓶）

2.血细胞培养基

3.胎牛血清

4.15mL锥形管

5. 离心机

6. 吸管

制备方法

1. 收到冷冻的 PBMC 后，立即解冻细胞并开始培养，以保持最高的细胞活力。

2. 要解冻细胞，请将小瓶放入 37°C 水中，轻轻搅拌约 1 分钟。

a. 注意：将盖子远离水以尽量减少污染风险。

3. 将细胞移入含有 10% 胎牛血清的 10 mL 新鲜血细胞培养基的 15 mL 锥形管中。

a. 注意：总体积 = 10.1 mL（100 µL PBMC + 9 mL 新鲜血细胞培养基 + 1 mL 胎牛血清）

4. 在室温下以 1,000 rpm (~220g) 离心 5 分钟。

5. 取出上清液，细胞即可使用。

PBMC 的单荧光团和双荧光团染色：

前两节中制备的缀合物和 PBMC 用于以下细胞表面免疫标记方案。

材料：

· 1.PBMC

· 2.HHBS 缓冲液（ 货号 20011）

· 3.测定缓冲液（含 1% BSA 的 HHBS 缓冲液）

· 4.台盼蓝钠盐*超纯级*（ 货号 2452）

· 5.TruStain FcX™CD45 – PE 结合物

· 6.CD45 – APC 缀合物

· 7.CD4 – FITC 缀合物

· 8.CD3 – APC 缀合物

· 9.小鼠 IgG – PE 缀合物

· 10.小鼠 IgG – APC 缀合物

· 11.NovoCyte 3000 流式细胞仪

PBMC 染色：

1. 在免疫标记之前，使用台盼蓝染料排除测试（2452）确定 PBMC 活力，每个样品使用 100 万个细胞。

2. 用 HHBS 缓冲液（ 20011）通过离心机以 1000 RPM 洗涤 PBMC 2 次，每次洗涤 5 分钟。

3. 为了阻断非特异性 Fc 介导的相互作用，将 PBMC 重悬于含有 1% BSA 溶液的 HHBS 缓冲液和 Human TruStain FcX™ 5 µL/100 µL 检测缓冲液中，并在室温10分钟。

4. 对于单荧光团 PBMC 染色，将 PBMC 与终浓度 0.1 µg 的 CD45-PE、CD45-APC、小鼠 IgG-PE 或小鼠 IgG-APC 在冰上避光孵育 20 分钟。

5. 对于双荧光团 PBMC 染色，将 PBMC 与 CD45-PE 和 CD4-FITC 以及 CD45-PE 和 CD3-APC 共孵育。所有四种染料的终浓度均为 0.5 µg，在冰上避光保存 20 分钟。

6. 用 Assay Buffer 清洗 PBMC 两次，然后将 PBMC 重悬于 Assay Buffer 中。

7. 在流式细胞仪上进行分析。

使用 Buccutite™ 缀合技术生成的缀合物可提供高质量的产量。这些缀合物在 PBMC 上进行了测试，并且可以灵活地与其他缀合物组合进行多色染色，以检测 PBMC 中的 CD 标记。

使用 CD45-PE、CD45-APC、CD4-FITC 和 CD3-APC 使用单荧光团和双荧光团对 PBMC 进行流式细胞术分析。密度图（最左边）用于从其他细胞群中排除淋巴细胞。直方图（右上）和密度图（右下）分别用于单次和多次荧光团染色。数据记录在 ACEA Biosciences 的 NovoCyte 3000 流式细胞仪上，并使用 NovoExpress 1.2.5 版进行分析。