1.百萤---Annexin V简介
Annexin V作为一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝an酸有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝an酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。
2.百萤---Annexin V适用仪器
Annexin V凋亡检测试剂盒适用仪器：流式细胞仪、荧光显微镜
3.百萤---Annexin V常见问题以及解答
Q:什么是Annexin V/PI测定？
A: Annexin V/PI测定用于通过annexin V标记区分早期凋亡细胞和通过丙碘胺(PI)标记区分坏死/死亡细胞。在早期凋亡阶段，细胞膜开始失去不对称性，导致磷脂酰丝an酸(PS)转位到膜的外表面，在此处annexin V共轭物可以检测到它。然而，在细胞膜破裂的情况下，例如坏死，annexin V共轭物可以进入并结合内层膜中的PS残基，导致假阳性结果。因此，建议使用不透过细胞膜的核染料(如PI)与annexin V共轭物一起使用。这使用户可以区分早期凋亡细胞(annexin V染色)、晚期凋亡细胞(annexin V和PI染色)和坏死细胞(仅PI染色)。
Q:Annexin V是什么颜色的？
A: 就其本身而言，Annexin V 是无色的且难以检测。 为了检测Annexin V 与磷脂酰丝an酸的结合，Annexin V 通常与异硫氰酸荧光素 (FITC) 结合，FITC 是一种绿色荧光化合物，激发峰为 491 nm，发射峰为 516 nm。 用 FITC 或任何其他绿色荧光染料标记Annexin V，例如 iFluor 488(Ex/Em = 491/516 nm)。
Q:Annexin V和TUNEL有什么区别？
A: 末端脱氧核苷酸转移酶 dUTP 缺口末端标记 (TUNEL) 是一种染色方法，用于识别细胞内 DNA 片段化位点——晚期细胞凋亡的标志性特征。 它使用酶末端脱氧核苷酸转移酶 (TdT) 将修饰的 dNTP(例如 dUTP)连接到片段化 DNA 链的 3'-羟基末端。 dNTPs 通常用荧光团修饰以促进量化和/或可视化。
Annexin V 染色通过结合由于细胞膜不对称性丧失而暴露在细胞外的 PS 残基来识别细胞凋亡的早期阶段。 Annexin V 通常用 FITC 等荧光团标记，以促进凋亡细胞的检测。
Q:Annexin V阳性是什么意思？
A: Annexin V阳性结果表明细胞处于凋亡的早期状态，该术语通常用于Annexin V/PI检测，通过根据细胞群的健康状况来区分细胞群。详情如下：
1.Annexin V 阴性/PI阴性：说明细胞很健康
2.Annexin V 阳性/PI阳性：说明该细胞处于坏死或凋亡晚期。
Q:什么是Annexin V的阳性对照？
A: Annexin V阳性对照是使用已知的细胞凋亡诱导方法诱导凋亡的细胞。 当用Annexin V 偶联物(例如膜联蛋白 V-FITC)染色时，这些细胞会产生阳性信号。 例如，细胞凋亡可通过在 55°C 下加热细胞 20 分钟或处理已知可诱导细胞凋亡的细胞试剂(如xi树碱或星形孢菌素)来诱导。
Q:什么是Annexin V结合缓冲液？
A: 在实验样品中，Annexin V结合缓冲液能够促进Annexin V与磷脂酰丝an酸(PS)结合。这些结合缓冲液需要含有足够高浓度的钙，使Annexin V与PS结合，但不能高到与其他磷脂结合。Annexin V结合缓冲液也可用于洗涤样品，使其不含过量的膜联蛋白和其他化学残留物质，以确保检测。染色前，应将细胞重悬于浓度为1x10^6/ml的Annexin V结合缓冲液中。
Q:Annexin V是怎样工作的？
A: Annexin V 通过结合暴露在细胞膜外侧的磷脂酰丝an酸 (PS) 残基来识别正在发生凋亡的细胞。 在活的健康细胞中，PS 残基位于质膜的内层，在那里它们无法与膜联蛋白 V 结合。 当细胞启动程序性细胞死亡(细胞凋亡)时，它们的质膜会失去不对称性。 PS 残基从膜的内部转移到外部小叶，在那里它们可以与膜联蛋白 V 结合。 Annexin V 通常与荧光团(如 FITC)结合，以促进凋亡细胞的检测。
Q:Annexin V染色后，能否进行细胞固定
A: 可以，细胞可以在Annexin V染色后进行固定操作。如果需要固定细胞，请满足以下三个条件：1.使用不含酒精的醛类固定。2.请使用含有CaCl2的缓冲液。3.避免使用洗涤剂或表面活性剂。注意事项：在Annexin V染色前，千万不要固定细胞，固定细胞会杀死细胞，而Annexin V染色只能在活细胞或组织上进行。
Q:Annexin V能染色坏死细胞吗？
A: 是的，Annexin V可以染色坏死细胞。坏死是指不正常的细胞死亡，可能由各种事件触发，包括组织缺血和缺氧或细胞区域的急性损伤。坏死细胞的一个关键特征是质膜破裂。这个事件使得Annexin V可以进入整个质膜，包括PS残基存在的内叶片，导致假阳性。因此，建议使用细胞不渗透染料(例如丙碘锭或7-AAD)与Annexin V结合物相结合，以消除假阳性并区分凋亡细胞和死亡细胞。图中使用Annexin V将凋亡细胞染成绿色，使用7-AAD将坏死细胞染成红色。
Q:染色完不能及时上机，样本能固定吗？
A: 细胞染色完成后，禁止固定，应尽快检测，若无法立即检测，可将样本管放冰上，减少外界环境对检测结果的影响，Annexin V 结合不稳定，请务必在标记结束后半小时内检测。
Q:如何统计凋亡细胞数？
A: Annexin V 凋亡实验在做凋亡统计时一般统计细胞早期凋亡率，也有文献统计总的凋亡比例(早期凋亡和晚期凋亡或坏死细胞之和)。
Q：血液样本是否可以用于凋亡检测？
A：如果样品来源于血液，请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有 PS，能与 Annexin-V 结合，从而对实验结果产生干扰。
Q：有没有更好的办法处理贴壁细胞，来做流式凋亡实验？
A：检测贴壁细胞时，若消化时间不易控制，建议用 Accutase 细胞消化液，对细胞损伤小且不会改变细胞膜上 PS 的分布。
Q:细胞凋亡早期，可以用Annexin V-FITC/PI双染色法区分活细胞、早期凋亡细胞和坏死细胞吗?
A: 在正常的活细胞中，磷脂酰丝an酸(phosphotidylserine，PS)位于细胞膜的内侧，细胞发生凋亡时，细胞膜发生变化，PS从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表面。Annexin-V(膜联蛋白-V)是一种分子量为35-36 KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。用荧光素(FITC、Alexa Fluor488等)标记的Annexin-V作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜即可鉴别凋亡细胞和活细胞。
坏死的细胞PS同样也会从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表面，Annexin-V也能识别坏死细胞表面的PS,所以Annexin-V无法区分坏死细胞和凋亡细胞。另外碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，能够与细胞内DNA结合，而且它不能透过完整的细胞膜。早期凋亡细胞和活细胞的细胞膜仍然完整，PI染料无法自由通过细胞膜进入细胞内与DNA结合，所以PI染料无法标记凋亡细胞和活细胞，而PI染料却能够通过坏死细胞的细胞膜与细胞内的DNA结合，坏死细胞内的PI染料被488nm激光激发后会发射红荧光，被相应通道接收。所以Annexin V和PI同时使用，就可以区分活细胞、早期凋亡细胞和坏死细胞。
图为Annexin-V/PI双染色后流式检测结果分析
以上就是百萤对Annexin V凋亡检测常见问题的整理，欢迎大家一起讨论。
