YIJI 细胞 NADPH 氧化酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

YIJI 细胞 NADPH 氧化酶活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用特异性抑制剂，通过反应系统测定

样品中还原型*腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化后峰值的降低，即采用比色法测定样品中酶活性

的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适合于各种细胞样品（动

物或人体）还原型*腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH 氧化酶）的特异活性检测。用于免疫、血

液研究、蛋白组学、病理生理学等研究。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能

稳定，反应优化，检测敏感。

技术背景

NADPH氧化酶，通常称为还原型*腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（reduced nicotinamide adenine

dinucleotide phosphate oxidase；NADPH oxidase；EC1.6.3.1）或还原型辅酶II氧化酶，是机体防御机制中的

重要元素。NADPH氧化酶由6个亚体构成：Rho GTP酶（Rho guanosine triphosphatase）和5个phox（吞噬细

胞氧化酶；phagocytic oxidase） 其中主要包含细胞膜嵌合蛋白质分子。（gp91phox、p22phox、flavocytochrome

b558等），以及位在细胞质内的蛋白质分子（p47phox、p67phox、p40phox、Rac1、Rac2等）。其zui特征性的

酶活性是超氧化物歧化酶敏感的还原型*腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶。细胞膜上的NADPH氧化酶被激

活，将还原型辅酶Ⅱ（NADPH）转变为氧化型辅酶Ⅱ（NADP），氧分子则获得电子形成超氧阴离子O2-，

由O2-又可生成H2O2和OH－。其超氧阴离子产物具有杀死微生物的功能。NADPH氧化酶异常将导致慢性肉

芽肿病（Chronic Granulomatous Disease；CGD）。基于底物还原型*腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），

在特异性抑制剂联苯基三价碘（diphenyleneiodonium；DPI）的存在下，受到NADPH氧化酶的催化作用，

转化为氧化型*腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP），产生吸光峰值的变化，通过分光光度仪（340nm波长）

检测，来测定NADPH氧化酶的特异活性。其反应方式为：

产品内容

YIJI 清理液（Reagent A）

YIJI 裂解液（Reagent B）

YIJI 缓冲液（Reagent C）

YIJI 反应液（Reagent D）

YIJI 阴性液（Reagent E）

YIJI 底物液（Reagent F）

YIJI 专性液（Reagent G）

产品说明书

毫升

毫升

毫升

毫升

毫升

微升

微升

1份

保存方式

1

保存 YIJI 清理液（Reagent A） YIJI 阴性液和（Reagent E） 4℃冰箱里，在其余的保存在在－20℃

冰箱里，避免反复冻融；YIJI 反应液（Reagent D）和 YIJI 底物液（Reagent F），避免光照，有

效保证 6 月

用户自备

15 毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

1.5 毫升离心管：用于样品操作和保存的容器

细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离

4℃（微型）台式离心机：用于样品处理

恒温培养箱或恒温水槽：用于反应物孵育

比色皿：用于比色测定的容器

分光光度仪：用于比色分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；YIJI 反应液（Reagent D）和

YIJI 底物液（Reagent F）注意避光。然后进行下列操作。

一、样品准备

准备好 25cm2细胞培养瓶或 60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1 至 5 X 106细胞）

小心加入 xx 毫升 YIJI 清理液（Reagent A），覆盖生长表面

小心抽去清理液

使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用*消化）

加入 xx 毫升 YIJI 清理液（Reagent A），混匀细胞

移入到预冷的 15 毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）

放进 4℃台式离心机离心 5 分钟，速度为 300g

小心抽去上清液

加入 xx 微升 YIJI 裂解液（Reagent B），充分混匀

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10. 转移到预冷的 1.5 毫升离心管

11. 强力涡旋震荡 15 秒

12. 置于冰槽里孵育 30 分钟

13. 放进 4℃微型台式离心机离心 5 分钟，速度为 16000g（或 13000RPM，例如 eppendorf 5415）

14. 小心移取 500 微升上清液到新的预冷的 1.5 毫升离心管

15. 移取 10 微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 YIJI Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－

GMS30030.1）

16. 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、测定准备

1． 从-70℃取出待测样品（例如细胞裂解悬液样品等），置于冰槽里

2． 设定好分光光度仪（温度为 30℃）：波长为 340nm，间隔 60 秒，读数 6 次（共 5 分钟），并置零

2

三、 背景对照测定

1． 移取 xx 微升 YIJI 缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升 YIJI 反应液（Reagent D）

3． 加入 xx 微升 YIJI 底物液（Reagent F）

4． 放进 30℃培养箱里静置 3 分钟

5． 加入 xx 微升 YIJI 阴性液（Reagent E）

6． 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）

7． 即刻放入分光光度仪检测，此为背景空对照：（340 波长读数）0 分钟－（340 读数）5 分钟

四、 样品总活性测定

移取 xx 微升 YIJI 缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

加入 xx 微升 YIJI 反应液（Reagent D）

加入 xx 微升 YIJI 底物液（Reagent F）

放进 30℃培养箱里静置 3 分钟

加入 100 微升待测样品（注意：50 至 100 微克细胞裂解悬液蛋白；样品须溶解；参见注意事项 5、11

1.

2.

3.

4.

5.

和 12）

6.

7.

上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）

即刻放入分光光度仪检测，此为样品总活性读数：（340 波长读数）0 分钟－（340 读数）5 分钟

五、 样品非特异活性测定

1． 移取 xx 微升 YIJI 缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升 YIJI 反应液（Reagent D）

3． 加入 xx 微升 YIJI 专性液（Reagent G）

4． 加入 100 微升待测样品（注意：50 至 100 微克细胞裂解悬液蛋白；样品须溶解；参见注意事项 5、11

和 12）

5． 放进 30℃培养箱里静置 3 分钟

6． 加入 xx 微升 YIJI 底物液（Reagent F）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）

8． 即刻放入分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：（340 波长读数）0 分钟－（340 读数）5 分钟

六、 计算样品活性

1）样品总活性

[（样品读数－背景读数）X 样品稀释倍数]÷[0.1（样品容量，毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 5（分钟）]

＝单位/毫升或微摩尔 NADPH/分钟/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克＝单位/毫克或微摩尔

NADPH/分钟/毫克

或者

[（样品读数－背景读数）X 样品稀释倍数]÷[0.1（样品重量，毫克）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 5（分钟）]

＝单位/毫克＝微摩尔 NADPH/分钟/毫克

3