组织固定
新鲜组织应及时固定，一般推荐使用10%中性福尔马林固定6-24小时。如果固定不够可能会造成蛋白弥散或降解，出现阴性染色或周边阳性中心阴性染色；如果过固定可能会造成蛋白空间结构交联过度，即使经过抗原热修复也难以出现阳性结果，或出现中心有阳性周围阴性的染色结果。可以将Vimentin作为检验标本的固定情况的指标，因为Vimentin蛋白抗原决定簇对醛类比较敏感，且Vimentin广泛分布于几乎各种组织中，如血管内皮细胞和间质细胞均阳性，所以可以参考Vimentin的染色结果来判断组织固定情况。
烤片
推荐烤片条件为56℃-60℃ 1-2小时或过夜。温度过高会破坏抗原决定簇，产生假阴性。
一抗
储存条件是否合适，有些抗体（如Santa Cruz公司的抗体）不能冷冻保存；避免抗体反复冻融；使用浓度过低；孵育时间过短；试剂是否在有效期内。随着储存时间延长，抗体的效价也会发生变化，应及时调整。
检测系统
所使用的检测系统是否和一抗匹配，通用型检测系统只能检测小鼠和兔来源的抗体，不能用于山羊来源的一抗的检测；如果检测系统中包含两种以上的试剂，注意使用顺序是否正确；注意检测系统的灵敏度，一般而言Polymer二步法检测试剂灵敏度高于SP三步法检测试剂，同等类型的检测系统中辣根酶检测系统的灵敏度是碱磷酶检测系统的四倍，目前我公司所售的检测系统中PV-9000是灵敏度zui高的产品，如果所检测的抗原含量较低，必须考虑这些因素。
显色系统
所使用的显色剂是否是检测系统中标记酶的底物，一般辣根酶用DAB（棕黄色）和AEC（红色）显色，碱磷酶用BCIP/NBT（蓝色）和AP-red（红色）显色，其中DAB的灵敏度zui高，是AEC的四倍。
封片
选择合适的封片剂至关重要。目前市售的封片剂分为两大类，一类是醇溶性的（如中性树胶、香味封片剂），一类是水溶性的（如GVA）。如果底物所产生的终末产物溶于有机溶剂（如AEC、AP-red等），就不适用醇溶性封片剂封片，否则会褪色乃至出现阴性结果。
其他步骤
组织切片上残留的PBS/TBS冲洗液过多，进一步稀释了抗体；蛋白含量过低或无表达，应设立阳性对照片；复染过深导致遮盖阳性信号，尤其是核阳性的抗体；某些抗原决定簇对H2O2敏感，如CD4，应用低浓度的H2O2或省略。
