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DNA测序技术主要依据 Sanger 的双脱氧链终止法。以DNA单链为模板,在特定条件下,用特异的引物在测序级DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则,不断将 4 种脱氧核糖核苷酸 (dNTP) 加到引物的 3'- 羟基末端并使引物链得到延伸。
DNA测序原理
DNA测序技术主要依据 Sanger 的双脱氧链终止法。以DNA单链为模板,在特定条件下,用特异的引物在测序级DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则,不断将 4 种脱氧核糖核苷酸 (dNTP) 加到引物的 3'- 羟基末端并使引物链得到延伸。这种链的延伸是通过引物的 3'- 羟基和脱氧核糖核苷酸底物的 5'- 磷酸基团形成磷酸二酯键来完成的。如果这种反应体系中加入双脱氧核糖核苷酸 (ddNTP) ,这种 2'3'ddNTP 的 5'- 磷酸基团是正常的 (4 种不同的荧光标记 ) ,而 3' 位置缺少羟基,因此在 DNA 聚合酶作用下,仍然可以通过 5'- 磷酸基团与引物链的 3'- 羟基反应掺入到引物链中,但是由于 ddNTP 没有 3'- 羟基,不能继续与下一个 5'- 磷酸基团形成磷酸二酯键而导致引物链延伸的终止。这样,在测序反应体系中, DNA 引物链不断合成与偶然终止,产生一系列的长短不等的核苷酸链,然后将这些反应产物进行电泳,即可得测序图谱。
样品要求
样品类型 | 相应要求 |
菌体 | 1. 说明载体抗性类型,我们提供 Amp, Kan, Tet 及 Chl 四种抗生素。 |
质粒 | 1. 质粒溶于适量体积双蒸水中(不含 TE ),电泳检测总量大于 2mg 。 2. 建议用相关试剂盒纯化。 |
未纯化 PCR 产物 | 1. 片段大于 150bp 。 |
纯化 PCR 产物 | 1.PCR 产物溶于双蒸水中(不含 TE )。 2. 浓度大于 20ng/ul ,体积大于 20ul ,长片段需适当增加量。 |
自备的引物 | 1. 浓度不低于 5pmole/ul( 或 5umol/L) ,体积大于 20ul 。 |
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