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上海研生实业有限公司
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阅读：489发布时间：2012-4-25
植物乳杆菌培养基的优化
发酵剂是影响发酵产品质量的关键因素, 它的制备需要有良好的*, 使植物乳杆菌得以大量增殖, 从而使其在经过喷雾干燥、冷冻、冻干等处理后有足够的活菌数存活。因此优化植物乳杆菌*是一项十分重要的基础研究工作。
植物乳杆菌是泡菜、发酵谷物、发酵肉制品等重要发酵剂的组成菌之一。植物乳杆菌K25分离于西藏灵菇中, 在对其进行研究时发现, 用MRS培养基培养该菌时, 菌落总数仅能达到6.7×107cfu·mL- 1 左右。菌液中活菌数的增加, 可以通过培养基的优化设计来实现, 因此需要对培养基进行优化, 提高菌液中活菌数的含量。本文旨在通过对植物乳杆菌的培养基进行优化, 从而获得活菌数较高的菌液, 为研制高活力的冷冻干燥发酵剂及其产品的开发奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验菌种
L. plantarum K25, 分离于西藏灵菇。
1.2 材料与设备
胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母膏、牛肉膏为生化试剂; K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4和各种糖类均为分析纯。
722 型分光光度计、立式压力蒸汽灭菌器、超净工作台、分析天平、DNG- 9240 型恒温鼓风干燥箱。
植物乳杆菌培养基的优化
1.3 培养基及培养条件
活化和计数培养采用MRS 培养基, 蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、KH2PO4 2 g、柠檬酸三钠2 g、乙酸钠2 g、葡萄糖20 g、Tween 80 1 mL、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g, 用蒸馏水定容至1 L, 调pH 6.2~6.4, 121 ℃灭菌15min。
以MRS 培养基为基础, 按照试验设计添加不同生长因子, 接种量0.5%接入150 mL 液体培养基中, 37 ℃静置培养24 h
1.4 方法
1.4.1 不同碳源、氮源、磷源的选择
在MRS 液体培养基的基础上, 分别添加2%（w/v） 乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖作为不同碳源; 选择胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母膏、牛肉膏, 分别加入2.5%（ w/v） 作为的不同氮源; 分别加入0.2%（ w/v） K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4 作为不同磷源, 其他组分均相同。在培养基中接入活化后植物乳杆菌, 在37 ℃的条件下培养24 h, 稀释10倍后, 在600 nm 条件下测定菌液OD 值, 以MRS培养基为对照, 比较其对植物乳杆菌生长的影响情况。
1.4.2 培养基的优化
采用正交试验设计优化碳源、氮源、磷源的用量, 因素水平如表1 所示。其中A 因素为蔗糖,B 因素为酵母膏, C 因素为KH2PO4, 测定菌液OD值。
表1 正交试验因素水平
| 水平 Level | 因素Factor | ||
| A | B | C | |
| 1 | 1 | 2.0 | 0.1 |
| 2 | 2 | 2.5 | 0.2 |
| 3 | 3 | 3.0 | 0.3 |
植物乳杆菌培养基的优化
1.4.3 OD 值测定
用722 型分光光度计, 将菌液稀释10 倍后,以相同条件下的未接菌的培养基做参比, 在600 nm下测定菌液吸光度。
1.4.4 菌落计数
以MRS 固体培养基为计数培养基, 采取适当的稀释倍数, 涂布于平板上, 37 ℃培养36~48 h后计数。
2 结果与分析
2.1 碳源对植物乳杆菌生长的影响
不同碳源乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖对植物乳杆菌的生长的影响结果见表2。
表2 不同碳源对植物乳杆菌生长的影响
| 种类 | 对照 | 乳糖 | 蔗糖 | 葡萄糖 | 果糖 |
| 吸光度（OD） | 0.21 | 0.18 | 0.24 | 0.22 | 0.20 |
由表2 可以看出, 植物乳杆菌在蔗糖为碳源的培养基中生长, OD 值为0.24 明显高于对照, 这可能由于植物乳杆菌K25 分离于西藏灵菇中, 而灵菇中含有大量的葡萄糖和蔗糖, 其中蔗糖能更好的被植物乳杆菌利用, 并促进其生长。而在乳糖和果糖为碳源时OD 值分别是0.18和0.20, 低于其它碳源, 不适于植物乳杆菌的生长, 因此确定蔗糖是*碳源。
2.2 氮源对植物乳杆菌生长的影响
氮源采用胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母膏, 牛肉膏, 以MRS 培养基为对照, 对植物乳杆菌的生长影响见表3。MRS 培养基中氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏, 由表3可以看出, 植物乳杆菌的生长在以酵母膏为单一氮源时, OD 值略高于对照, 明显高于植物乳杆菌在其它氮源中的生长可能是由于植物乳杆菌K25分离于西藏灵菇中, 所利用的氮源与酵母膏中所含有的氨基酸同源或是氨基酸组成相似; 植物乳杆菌在以胰蛋白胨和大豆蛋白胨为氮源时生长效果较差, OD 值仅为0.328 和0.338; 牛肉膏是MRS 培养基中的氮源, 单独添加时不利于植物乳杆菌的生长, 不能很好的促进菌种生长, 菌液的OD 值zui低。
表3不同氮源对植物乳杆菌生长的影响
| 种类 | 对照 | 胰蛋白胨 | 大豆蛋白胨 | 酵母膏 | 牛肉膏 |
| 吸光度（OD） | 0.39 | 0.328 | 0.338 | 0.47 | 0.316 |
2.3 磷源对植物乳杆菌生长的影响
磷源采用K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4,由表4 可以看出, 在K2HPO4 为磷源时植物乳杆菌的OD 值是zui小值0.256, 可能是因为K2HPO4 的添加改变了培养基的pH, 不利于植物乳杆菌的生长;而以KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4 为磷源时OD 值相差不多, 都在0.3 左右; 原基本培养基中磷源即为KH2PO4, 作为生长因子能够很好的促进植物乳杆菌的生长, OD 值为0.38, 因此确定采用原培养基中的KH2PO4。
表4不同氮源对植物乳杆菌生长的影响
| 种类 | 对照 | * K2HPO4 | 磷酸二氢钾 KH2PO4 | * Na2HPO4 | * NaH2PO4 |
| 吸光度（OD） | 0.39 | 0.256 | 0.31 | 0.28 | 0.38 |
2.4
根据单因素试验的结果, 设计正交试验, 因素A、B、C 分别为蔗糖、酵母膏、KH2PO4, 以吸光值（OD600nm）为评价指标, 测定结果和相应的极差分析见表5.
由表5 可以看出, 各因素对植物乳杆菌的生长影响次序依次是: 蔗糖>KH2PO4> 酵母膏。蔗糖的添加量是影响指标值的zui主要因素, 酵母膏添加量对指标值影响zui小。
表5 正交试验因素水平
| 试验号 Trial number | 因素Factor | OD600nm | ||
| A | B | C | ||
| 1 | 1.0 | 2.0 | 0.1 | 0.347 |
| 2 | 1.0 | 2.5 | 0.2 | 0.586 |
| 3 | 1.0 | 3.0 | 0.3 | 0.135 |
| 4 | 2.0 | 2.0 | 0.2 | 0.744 |
| 5 | 2.0 | 2.5 | 0.3 | 0.755 |
| 6 | 2.0 | 3.0 | 0.1 | 0.836 |
| 7 | 3.0 | 2.0 | 0.1 | 0.743 |
| 8 | 3.0 | 2.5 | 0.3 | 0.687 |
| 9 | 3.0 | 3.0 | 0.2 | 0.735 |
| K1 | 0.356 | 0.608 | 0.623 | |
| K2 | 0.778 | 0.676 | 0.688 | |
| K3 | 0.719 | 0.596 | 0.544 | |
| R | 0.422 | 0.107 | 0.144 | |
当蔗糖添加量为1%时, 不利于植物乳杆菌的生长, 随着蔗糖添加量的增加, 指标值明显增大, 但是添加量为3%时, 指标值下降, 说明过多的碳源并不利于植物乳杆菌的生长, 蔗糖添加量为2%时。KH
3 结论
a. 适合植物乳杆菌生长的培养基中, *碳源、氮源、磷源分别是蔗糖、酵母膏、KH2PO4。
b. 采用正交试验优化后植物乳杆菌培养基中各因素用量为酵母膏2.5%、蔗糖2%、KH2PO4 0.2%。
c. 优化后的植物乳杆菌的活菌数达3.0×108cfu·mL- 1, 为植物乳杆菌发酵剂的进一步研究奠定了基础。
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