人胚肾细胞培养基的配制：

实验步骤：在超净台内，安装好滤器。

用去离子水溶解1640培养基，并用磁力搅拌器搅拌2 h，使之充分溶解。

在超净台内过滤。

分装到250 mL的玻璃瓶内。

用封口膜封好，-20℃保存，过滤结束时，还要取少许培养基进行菌培，验证培养基是否是无菌。

胎牛血清的处理：

没有灭活的血清中含有补体成分，需要将血清在56℃条件下灭活30 min。在水浴锅内进行，灭活的过程中，要不停地摇晃，使受热均匀，防止沉淀析出来。

注意：

刚取出的冻存血清不要立即放入56℃中，因为突然的温度升高会使装血清的玻璃瓶破裂，应该放在室温逐渐溶解，然后，再进行灭活处理。

生长培养基的配制：

90 mL IMDM中加入大约10 mL的胎牛血清（10% 左右），双抗可以不加。

（有资料表明双抗对细胞有一定的毒副作用）Hanks 和D-Hanks液，以及*的配制Hanks液是一种常用的*，D-hanks液是不含钙镁的Hanks液。它们与细胞的生长状况下的pH值和渗透压一致，细胞在Hanks液中可生存几个小时，Hanks液主要用于清洗细胞。

D-Hanks液主要用于配制*。配制Hanks液需将CaCl2溶于蒸馏水，再将其它试剂配制成溶液，将两次配制的溶液混合，定容。*是一种常用的细胞消化液，在原代培养时，用*消化，使细胞从组织块中游离出来。

传代培养时，用*消化贴壁的细胞，并分散成单个细胞。

*分离细胞的能力与不仅与*作用的温度、时间、浓度和pH有关，还与细胞的类型和特性有关。

用于原代培养消化组织块采用的浓度为：0.1% 或 0.125%；

用于传代培养采用的*浓度为：0.25%或者0.2%。

*的配制：

1）由于*的作用主要机制是通过螯合钙镁离子，而钙镁离子是保持细胞和细胞之间相互连接所必需的，所以，*的配制用无钙镁的D-Hank液，避免钙镁离子干扰*的活性。

2）*在pH8.0时活性zui强，在过滤除菌前，须用NaHCO3干粉调溶液的pH值。

3）*受热容易分解，所以避免盛夏配制，在配制过程中，温度保持在4℃，zui后-20℃冻存。反复冻溶会影响*的活性，要分装冻存。

4）血清能降低*的活性，所以，在终止*的消化反应时，可加入含有血清的培养基。

[实验步骤]

配制Hanks液，高压灭菌，4℃保存。称取*，在冰浴上进行研磨，并加入少量的D-Hanks液，使其呈糊状，zui后用D-Hanks定容，过滤除菌。

分装后，-20℃保存。

人胚肾细胞细胞传代培养[实验步骤]

1、准备工作：

1）肥皂洗手，在进行无菌操作前，用75% 的酒精擦拭双手，注意指间，和指甲周围。同时，用酒精棉球擦拭超净台。

2）将培养液放置室温，备用。

3）打开超净台内的紫外灯，照射20 min。同时，将实验所需材料也放入超净台进行灭菌（血清、培养基除外）

4）倒置显微镜下，观察细胞的状态，是否已经长满培养瓶，需要进行分瓶。

2、关闭超净台的紫外灯，打开风机。

3、点燃酒精灯，取出刻度吸管，在火焰上略烧，然后，安上吸球待用。

4、在打开培养瓶之前，用酒精棉球擦拭瓶盖，打开后，瓶口在酒精灯上过火焰，再用吸管轻轻吸出旧的培养液，注意，吸管不要碰到布满细胞的培养瓶的侧壁。

5、将*加入培养瓶内,显微镜下随时观察，见到细胞的突起消失，变圆时，立即翻转培养瓶，吸出*。记住不要消化时间过长，否则，细胞会被*消化掉。

6、加入适量Hanks液或培养基清洗一遍，立即倒掉。

7、加入含有10%血清的培养基，用吹打管吹打，一定要轻轻吹打，使其从瓶壁上脱落分散到培养基中，再补加培养基，按1:3进行分瓶。

然后，用火焰烧培养瓶的瓶口和盖，再盖好培养瓶的盖，放到培养箱中进行培养。

以上介绍的是贴壁细胞的传代培养方法，对于悬浮细胞的传代培养方法，只需要将细胞进行离心，1000 rpm，5 min,然后，换入新的培养基即可。

再分装到不同的培养瓶中进行培养。

不健康的细胞质中有空泡，细胞内有颗粒样物质，细胞间空隙增大，变形，不规则，失去原有的特点。

是否污染：

传代或换液24~ 48 h注意观察细胞是否被污染，污染的细胞培养液变浑浊，镜下可见有大量菌丝。如果细胞生长缓慢，生长特性改变，胞质内颗粒性物质增多，尽管培养液不变浑浊，考虑可能有支原体污染。污染的细胞立即从培养箱中取走，以免污染其它细胞。

实验四、

细胞冻存与复苏[实验步骤]

1. 为了保证细胞良好的状态，在细胞冻存的前一天使细胞处于对数增长期，同时将细胞换液，次日，按照细胞传代培养方法，用*消化贴壁细胞，将细胞用培养基冲下来，然后，用50 mL尖底离心管离心，1000 rpm，4min，弃上清，收集细胞。

2. 加入适量的冻存液（10% DMSO 和 90%含有20%血清的IMDM培养基）

3. 分装到冻存管中，做好标记，标明细胞名称，保存时间，所用培养基等。

4. 4℃放置30 min；-20℃放置1.5 h； -70℃放置12 h；zui后移到液氮罐中。

细胞的复苏：细胞的复苏原则是快速溶化，因为如果缓慢的溶化，会使进入细胞的水分形成冰晶，对细胞造成伤害，因此，在复苏细胞时，将冻存细胞直接放到37℃的水浴中，使其迅速溶解。在超净台内将冻存管内的细胞悬浮液直接倒入小培养瓶或培养皿内，然后，加入3 mL的培养液。次日，观察细胞生长情况，并更换细胞培养液。