抗大肠埃希氏菌O157抗体，Anti-E.coli O157

 （一）操作步骤
1．DEAE-Sephadex
A-50预处理 　称DEAE-SephadexA-50（下称A-50）5g，悬于500ml蒸馏水内，1h后倾去上层细粒。按每克A-50加0.5mol/LNaOH 15ml的比例，将A-50浸泡于0.5mol/LNaOH液中，搅匀，静置30min，装入布氏漏斗（垫有2层滤纸）中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至pH呈中性；再以0.5mol/LHCl同上操作过程处理，zui后以0.5mol/LNaOH 再处理一次。处理完后，将A-50浸泡于0.1mol/LpH7.4PB中过夜 。
2．装柱
（1）将层析柱垂直固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。
（2）将0.1mol/L,pH7.4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50。等A-50。等A-50凝胶沉降2～3cm高时，开启出水口螺旋夹，控制流速1ml/min，同时连续倒入糊状A-50凝胶至所需高度。
（3）关闭出水口，待A-50凝胶*沉降后，柱面放一圆形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口。通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。
3．平衡 　　
启开出水口螺旋夹，控制流速12～14滴/min。使约2倍床体积的洗脱液流出。并以pH计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之pH值与离子强度，两者达到一致时关闭出水口，停止平衡。
4．加样及洗脱   
启开上口橡皮塞入下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品（体积应<床体积2%，蛋白浓度以<100mg为宜）。松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内，至与柱面相切时，立即关闭下口，以少量洗脱液洗柱壁2～3次；再放开出水口，使洗液进入床柱，随后立即于柱面上加入数毫升洗脱液，紧塞柱上口，使整个洗脱过程成一密闭系统。并控制流速12～14滴/min。
5．收集 　
开始洗脱的同时就以试管进行收集。每管收集3～5ml。共收集10～15管。
6．测蛋白 　　
以751型紫外分光光度计分别测定每管OD280nm, 与OD260nm,按公式计算各管蛋白含量 。并以OD280nm为纵座标，以试管编号为横座标，绘制洗脱曲线。
7．合并、浓缩　 
将洗锐峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并，以PEG（MW6000）浓缩至所需体积，加入0.02%NaN3防腐，于4℃保存备用。长期保存时应贮于-40℃冰箱。
8．A-50凝胶的再生　　 
在柱上先以2mol/LNaCl洗脱蛋白至流出液的OD280nm<0.02，再以蒸馏水洗去柱中盐。然后按预处理过程将A-50再处理一遍即达到再生。近期用时泡于洗脱缓冲液中4℃保存；近期不用时，以*洗2次，再置50℃温箱烘干，装瓶内保存。
抗大肠埃希氏菌O157抗体，Anti-E.coli O157 （二）注意事项
（1）柱的选择：从理论上说，只要柱足够长，就能获得理想的分辨率，但由于层析柱流速同压力梯度有关，柱长增加使流速减慢，峰变宽，分辨率降低。柱的直径增加，使流体流动的不均匀性增加，分辨率明显下降。
（2）纯化过程必须严格控制缓冲液的pH及离子强度。样品与A-50凝胶必须用洗脱缓冲液*平衡后，才能进行柱层析。
（3）所装的柱床必须表面平整，无沟流及气泡，否则应重装。
（4）洗脱过程中应严格控制流速，切勿过快。
（5）上样的体积要小，浓度不宜过高。
（6）加样及整个洗脱过程中，严防柱面变干。
四、SPA-Sepharose CL-4B 亲合层析纯化 
IgG及IgG亚类