支原体污染检测试剂盒（PCR法）

（PCR Mycoplasma Detection Kit）

Cat number：YS012

Store at -20℃ for one year

Expire date：

For Research Use Only

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一、 试剂盒说明

本试剂盒通过PCR法对细胞培养物、动物分泌物等多种生物材料进行支原体污染检测。常规培养法进行支原体检测一般需要几天的时间，而本试剂盒通过PCR扩增及电泳分析进行支原体检测只需几个小时，方便快捷。本试剂盒的多对引物能特异性扩增多种支原体rRNA基因片段，一次就可以检测至少11种的支原体，包括M. fermentans，M. hyorhinis，M. arginini，M. orale，M. salivarium，M. hominis，M. pulmonis，M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyponeumoniae, M. capricolum 等。其原理是原核生物的rRNA碱基序列非常保守，而rRNA操纵子上编码rRNA的DNA间隔区如16S和23S间隔区，各种生物种间的碱基序列差别很大。这个间隔区的DNA序列及长度在支原体各个种间既有相对保守的部分，也有具有很大差异的部分。因此可以在编码16S和23S rRNA的DNA上设计一对引物，扩增编码16S和23S rRNA的DNA间隔区，然后在编码16S和23S rRNA的DNA间隔区的保守区上设计一条引物，在编码23S rRNA的DNA上设计一条引物进行嵌套式PCR。能特异性检测出支原体DNA，检测灵敏度与特异性都很高。

二、试剂盒组份

三、试剂盒以外自备仪器和试剂

离心机、微量移液器、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、dNTPs（10mM）、琼脂糖、溴化乙锭等

四、使用注意事项

整个实验，应规范操作，反应体系的配制、样本处理及加样、PCR扩增应分区域进行，以避免交叉污染。

五、 操作方法

1.收取待检样品（细胞一般生长至80％左右即可，贴壁细胞不宜用消化液消化细胞，可以使用细胞刮刮取细胞），然后取细胞悬液200ul（约1～3×105细胞数）至离心管，12000rpm离心5～10min；去上清，加入50ul DNA溶解液，充分悬浮沉淀物，沸水浴5min；样品使用前12000rpm离心5～10min，取上清4ul作为PCR反应模板；剩余样品可以-20℃保藏。样本有时也可以直接用污染液直接做PCR反应。

2.PCR反应

*步PCR：

50μL体系PCR反应（如客户需要使用更小量的反应体系，试剂加样量按比例进行减少）：

（1）．使用前每个组份轻轻混匀，然后2000rpm离心20s；

（2）．取灭过菌的0.2mL离心管，在冰上依次加入

10×Taq Buffer                   5  μL

dNTPs （10mM）                  1  μL

MgCl2 （25mM）                  4  μL

Myc F1 （10μM）                 1  μL

Myc R1 （10μM）                 1  μL

DNA样品                      1~5 μL

Taq DNA Polymerase             0.5 μL

ddH2O up to                     50 μL

（3）．轻轻混匀，2000rpm离心20s；

（4）．进行PCR扩增

PCR扩增条件：

94°C，5min；

94°C，30 sec；55°C，2min；72°C，1 min；32 Cycles；

72°C，10 min，

第二步PCR：

50μL体系PCR反应（如客户需要使用更小量的反应体系，试剂加样量按比例进行减少）：

（1）．使用前每个组份轻轻混匀，然后2000rpm离心20s；

（2）．取灭过菌的0.2mL离心管，在冰上依次加入

10×Taq Buffer                   5  μL 

dNTPs （10mM）                  1  μL

MgCl2 （25mM）                  4  μL

Myc F2 （10μM）                 1  μL

Myc R2 （10μM）                 1  μL

*步产物                    1~5 μL

Taq DNA Polymerase             0.5 μL

ddH2O up to                     50 μL

（3）．轻轻混匀，2000rpm离心20s；

（4）．进行PCR扩增

PCR扩增条件：

94°C，5min；

94°C，30 sec；55°C，2min；72°C，1 min；32 Cycles；

72°C，10 min，

3.反应结束后，取反应液10μL进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR反应产物。如果此PCR产物需用于以后实验，应将PCR产物冷冻保存。

4.根据感染支原体类型的不同，扩增产物大小有所不同，*步PCR产物在350～700bp 之间，第二步PCR产物在150～250bp之间。