上海金穗生物科技有限公司

制备用于抗原上选择的噬菌体抗体

时间:2012-12-26阅读:374
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转化后,就得到了菌苔形式的抗体文库。可以制备成甘油储存物保存于一80℃。这是一个原始文库,象征着具有*价值的资源。的抗体文库也是由这种原始文库制备而来的。然而,当用大培养板铺板扩增原始文库时,会造成部分多样性的丢失。因此在任何噬菌体制备或细菌扩增步骤中,接种量必须总是大于5倍的文库容量,从而保持文库的多样性。

在大多数噬菌体展示载体中,抗体片段的表达是由lacZ启动子启动的。尽管这个启动子存在某些漏洞并可以优化,但以以下一些指导进行操作,其效果依然良好。在噬菌体救援前,含有抗体文库的细菌在葡萄糖存在的条件下,可生长至对数期。葡萄糖可抑制lacZ启动子的活性,因此使pⅢ和抗体表达都下降。这就有两点重要作用:一是由于pⅢ和抗体产生的毒性下降,防止了文库的偏性发生;二是抑制了pⅢ表达就可允许细菌纤毛表达,从而使辅助噬菌体能进行感染。如果没有葡萄糖,感染效率会急剧下降,结果大大降低了抗体文库的有效容量:辅助噬菌体感染后,则须去除葡萄糖,以便让pⅢ和抗体进行表达。而后,低水平lacZ启动子驱动pⅢ表达,但这已足以进行有效的展示了。用异丙基硫代半乳糖苷(1PTG)诱导启动子达不到预期效果,反而大大降低了展示水平。这是由pⅢ和抗体融合蛋白的毒性及pⅢ抗体融合蛋白的降解所致。对于scFv文库和Fab文库,过夜生长阶段的典型温度是30℃;此温度下,抗体展示水平似乎更佳。选择前,先用PEG沉淀法从培养基上清中制备噬菌体。这样就可以去除不*抑制或蛋白水解切除所产生的抗体片段。这些抗体片段能与噬菌体竞争结合。PEG沉淀也可以去除其他任何能干扰选择的污染物。如果计划长期保存噬菌体,推荐接着进行氯化铯离心纯化。
 

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