方法步骤:
1) 经BamHI 及HindIII 作用的pBlueGus 及pQE31,置65℃水浴10 min,移至冰浴降温后,以含EtBr 的1.0% agarose gel 进行电泳。
2) NA 45 以灭过菌的剪刀剪成适当大小,置于培养皿中,以10 mM EDTA-8.0浸泡处理10 min,继以0.5 M NaOH 处理5 min。 以无菌水快速清洗五、六次后,浸泡于无菌水中,置于4℃可保存数周。
3) 电泳后的胶片以EtBr 染色后,以长波长UV 灯观察DNA 片段所在位置,并在DNA 色带前后切一刀,以扁平药匙辅助将NA 45 插入DNA 前后的切缝中;再以UV 灯观察NA 45 插入的位置是否恰当。
4) 将胶片置回电泳槽中,以100 V 进行电泳约10 min (时间随NA 45 位置与DNA 距离而定);以UV 灯观察DNA 是否*吸附到NA 45。
5) 将NA 45 取出,浸于NET中漂洗以去除附着于NA 45 的胶体 (可用微量移液器头末端将胶体轻轻去除),再移置于微量离心管中 (每2~3 片置于一管中),吸去多余的液体。
◆ 注意! 不可让NA 45 干掉,否则DNA无法被溶离下來。
6) 加入0.3 mL high salt NET,于68℃加热40 min,其间不时震荡。
◆ NA 45 膜片避免重迭在一起,并且必须*浸泡于溶液中。
7) 将溶液吸出,原管中的NA 45 再加入300 μL high salt NET,于68℃加热10min。
◆ 以下的步骤常容易出错,请务必分清楚离心后该取上层或下层溶液,请先保留各部份的溶液,确定无误后再丢弃。
8) 将两次溶离液合并,加入等体积的n-butanol,震荡混合,以12,000 rpm 离心5 min。离心后应可分为两层,DNA 溶液在下层。仔细观察管底是否有沉淀,吸取下层溶液至另一离心管,避免吸到沉淀。 这时DNA 溶液体积应该减少,可以把两管或三管的溶液合并成一管。
◆ 溶离后的NA 45 请以UV 照射检查是否仍有DNA 残留。
9) 加入等体积的PCI,震荡混合,以12,000 rpm 离心5 min。
10) 吸取上层水溶液至另一离心管,原管中加入等体积的TE-8.0,混合均匀,以12,000 rpm 离心2 min。将上层液吸出。
11) 合并上层液,加入等体积CI,震荡混合,以12,000 rpm 离心2 min。
12) 将上层溶液吸出,加入0.2 倍体积的10 M NH4OAc,2.5 倍体积的酒精,置 -20℃沉淀至少 30 min。
13) 以12,000 rpm离心20 min (4℃),沉淀以 -20℃预冷的70%酒精洗两次,以同转速离心2 min。
◆ 倒掉上清时请小心,不要让沉淀流失! 沉淀通常很少,且因纯度高,沈淀几近透明,不易察看;上清吸到另一微量试管中暂时保留。
14) 沉淀干燥后溶于20 μL TE-8.0 中。
15) 取一个直径3 cm 的培养皿,加入5 mL TE-8.0。以平端镊子小心夹取VSWP滤膜,将滤膜的光亮面朝上置于液面上。 将溶离的DNA 溶液加在膜上,静置透析至少30 min 以去除残留的盐。
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