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C1q放射免疫测定法
点击次数：284 发布时间：2013-5-9
C1q放射免疫测定法
实验试剂
CFD稀释液（即VBS），10%三氯醋酸，C1q溶液
实验设备
PEG（MW6 000），离心机
实验步骤
1. C1q标记法C1q的同位素标记，一般用125I，也可用131I。
125I的标记有两种方法，即氯胺T法和乳过氧化物酶法。下面介绍氯胺T法：
1） 在100μl C1q（1mg/ml）中，加入100μCi125I，混匀，然后加入25μl 0.4mol/L PB（pH值7.4，含1mg氯胺T），冰浴中搅拌4～6min；
1） 在100μl C1q（1mg/ml）中，加入100μCi125I，混匀，然后加入25μl 0.4mol/L PB（pH值7.4，含1mg氯胺T），冰浴中搅拌4～6min；
2） 立即加入50μg/μl偏重亚硫酸钾中止反应，再加入50μl 1%牛血清白蛋白作为载体蛋白；
3） 过Sephadex G25柱（20cm×0.5cm，预先用pH值7.4、0.4mol/L PB平衡，并注入1ml 1%牛血清白蛋白），以与游离125I 分开；
4） 以适当浓度分装后，放-70℃保存。为减少自身凝集，加入0.02%Tween20。
2. 取标记好的C1q，用CFD稀释到1mg/ml。
3. 7 000r/min离心30min（4℃），除去不溶性凝聚蛋白，上清液存放于4℃。
4. 取试管4支，每管加测定血清0.2ml，CFD 0.2ml，标记C1q 50μl（1μg/ml）。1、2管为测定管，3、4管为对照管。
5. 摇匀后，放25℃温箱60min，取出再放4℃冰箱60min。
6. 各管加3ml PEG，zui终浓渡为2.5%，摇匀后，放4℃ 2h。
7. 3、4管加10%三氯醋酸，沉淀所有的蛋白。将4个管都以1 000r/min离心20min，去上清液，沉淀物放γ计数器内测cpm。
8. 计算
B=（a加b2加c加d2）×100
B：标记C1q结合量（%）。a、b：1、2管（测定管）cpm。c、d：3、4管（对照管）cpm。