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植物基因
点击次数：417 发布时间：2013-6-3
植物基因组DNA的RFLP
实验原理
DNA多态性是指DNA碱基顺序的差异性。这种差异性不仅存在于不同的植物之间，也存在于同一种植物的不同个体之间。RFLP多态性是指DNA限制性内切酶酶切片段长度的多态性（restniction fragment length olymophorphism）。由于碱基顺序的差异，在不同的种或同一个种的不同个体之间，它们的基因组DNA限制性内切酶位点的种类和数目不同，经特定的限制性内切酶切割后，所产生的限制性酶切片段在大小（长度）和数目方面自然也存在着差异。通过琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙锭染色，在紫外检测仪下观察，即可直接看到这种差异。电泳分离后，通过Southern杂交也可显示出已知DNA的差异。
实验试剂
1. 限制性内切酶
2. 10×限制性内切酶缓冲液
3. 0.5M EDTA（pH 8.0）
4. 溴化乙锭
5. 琼脂糖
实验设备
1. 电泳仪和电泳槽
2. 微量离心管
3. 低温冰箱
4. 37℃水浴锅
实验材料
从不同植物或同一植物不同个体分离出的基因组DNA。
实验步骤
1. 限制性内切酶酶切
1） 将在-20℃冷冻的DNA在冰上融化。
2） 取8支微量离心管按下表所示作好标记，并依次加入所需成分。
| | 品种I | 品种II | 品种I－1 | 品种II－2 | ||||
| 单酶切 1# | 双酶切 2# | 单酶切 3# | 双酶切 4# | 单酶切 5# | 双酶切 6# | 单酶切 7# | 双酶切 8# | |
| DNA | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 10×缓冲液 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| Eco R I | | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Hind III | | 1 | | 1 | | 1 | | 1 |
| 无菌水 | 7 | 6 | 7 | 6 | 7 | 6 | 7 | 6 |
| 总体积（ul） | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 |
3） 混匀，慢速离心2秒，使溶液全部聚于管底。
4） 37℃保温2－3小时。
5） 加入1／10体积的0.5M EDTA溶液终止反应。
2. 琼脂糖凝胶电泳分析