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流式细胞术急性分离小鼠小胶质细胞
点击次数：413 发布时间：2013-6-8
流式细胞术急性分离小鼠小胶质细胞
实验步骤
1. 小鼠用pH值7.4，0.1M PBS*穿心灌注。
2. 用剪刀去头。
3. 剥开头骨的软组织。
4. 除去下颌骨。
5. 除去头骨延髓到上颌骨之间的组织。
6. *刀，取出头骨顶部，顺时针方向切割，开始和结束于右后鼓膜钩。
7. 舀出大脑，维持组织的完整性。
8. 立即将脑组织置于预冷的流式细胞术缓冲液中（1％BSA 1mM的EDTA的 pH值7.4 0.1M PBS，50U/ml DNAseI）。如果计划标记神经元，应在缓冲液中添加l-*以防止在制备过程中的神经细胞死亡。
9. 用杜蒙5＃镊子从大脑的外表面仔细剥离脑膜（硬脑膜、蛛网膜和软脑膜）。
10. 使用*作冠状切口分离大脑和小脑/脑干。
11. 使用镊子分离小脑和脑干,小心剥离出第四脑室脑膜衬砌。
12. 使用*，纵向平分，小心剥离出大脑脉络丛及相关的脑膜组织。
13. 进一步解剖到所需分析的脑区（如海马，大脑皮层等）。
14. 将脑组织转移到15MLTenbroeck homogenizer中，其中含有10毫升冰冷的FACS缓冲液。
15. 轻柔震荡3次破碎组织。
16. 粗匀浆，经过70微米尼龙网状带有塑料柱塞的细胞过滤装置，每柱2次，产生单细胞悬液。
17. 离心细胞，4ºC， 1200 转/10min，弃掉上清液，再加上细胞流式细胞仪的缓冲液。
18. 用Miltenyi AutoMACS除去髓磷脂，根据指示髓鞘去除珠。
19. 1× 流式细胞仪缓冲液洗细胞，4ºC，1100转/10min，弃掉上清液。细胞重置在100 UL预冷的，细胞流式细胞术的缓冲液中再转至细胞流式细胞仪管中。
20. 把细胞标记上带有抗CD11b，CD45的细胞外的小胶质标记物、可修复的LIVE/DEAD染料或者任何其他所需标记（例如GFAP，NeuN，CD3e等），4度避光反应30min。
21. 洗涤细胞2次，如步骤19所示。
22. 在100-400uL含1％PFA PBS溶液（0.1M，PH=7.4）中重新悬浮细胞。4℃避光存储。
23. 在流式细胞仪检测细胞。
24. 首先用LIVE/DEAD设置gate，选择活细胞，然后依据脉冲宽度与面积比选择线性分布细胞，依据前向散射与侧散射比来消除碎屑。然后依据不同细胞类型的相应标记来获得等效和准确的细胞计数。
2. 用剪刀去头。
3. 剥开头骨的软组织。
4. 除去下颌骨。
5. 除去头骨延髓到上颌骨之间的组织。
6. *刀，取出头骨顶部，顺时针方向切割，开始和结束于右后鼓膜钩。
7. 舀出大脑，维持组织的完整性。
8. 立即将脑组织置于预冷的流式细胞术缓冲液中（1％BSA 1mM的EDTA的 pH值7.4 0.1M PBS，50U/ml DNAseI）。如果计划标记神经元，应在缓冲液中添加l-*以防止在制备过程中的神经细胞死亡。
9. 用杜蒙5＃镊子从大脑的外表面仔细剥离脑膜（硬脑膜、蛛网膜和软脑膜）。
10. 使用*作冠状切口分离大脑和小脑/脑干。
11. 使用镊子分离小脑和脑干,小心剥离出第四脑室脑膜衬砌。
12. 使用*，纵向平分，小心剥离出大脑脉络丛及相关的脑膜组织。
13. 进一步解剖到所需分析的脑区（如海马，大脑皮层等）。
14. 将脑组织转移到15MLTenbroeck homogenizer中，其中含有10毫升冰冷的FACS缓冲液。
15. 轻柔震荡3次破碎组织。
16. 粗匀浆，经过70微米尼龙网状带有塑料柱塞的细胞过滤装置，每柱2次，产生单细胞悬液。
17. 离心细胞，4ºC， 1200 转/10min，弃掉上清液，再加上细胞流式细胞仪的缓冲液。
18. 用Miltenyi AutoMACS除去髓磷脂，根据指示髓鞘去除珠。
19. 1× 流式细胞仪缓冲液洗细胞，4ºC，1100转/10min，弃掉上清液。细胞重置在100 UL预冷的，细胞流式细胞术的缓冲液中再转至细胞流式细胞仪管中。
20. 把细胞标记上带有抗CD11b，CD45的细胞外的小胶质标记物、可修复的LIVE/DEAD染料或者任何其他所需标记（例如GFAP，NeuN，CD3e等），4度避光反应30min。
21. 洗涤细胞2次，如步骤19所示。
22. 在100-400uL含1％PFA PBS溶液（0.1M，PH=7.4）中重新悬浮细胞。4℃避光存储。
23. 在流式细胞仪检测细胞。
24. 首先用LIVE/DEAD设置gate，选择活细胞，然后依据脉冲宽度与面积比选择线性分布细胞，依据前向散射与侧散射比来消除碎屑。然后依据不同细胞类型的相应标记来获得等效和准确的细胞计数。