细胞样品

甲醛*PBSSDS Lysis Buffer洗脱液RNaseA蛋白酶Komega胶回收试剂盒

离心管超声仪电泳仪离心机

一、细胞的甲醛交联与超声破碎（ *天）

1.  取出1平皿细胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9 ml）。

2.  37℃孵育10 min。

3.  终止交联：加*至终浓度为0.125 M。450 ul 2.5 M*于平皿中。混匀后，在室温下放置5 min即可。

4.  吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。

5.  细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。

6.  倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×10⁶个细胞。这样每100 ul溶液含1×10⁶个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×10⁶个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×10⁶个细胞。因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800 ul。

7.  超声破碎：VCX750，25%功率，4.5 s冲击，9 s间隙。共14次。

二、除杂及抗体哺育 （ *天）

1.  超声破碎结束后，10 000 g 4℃离心10 min。去除不溶物质。

2.  留取300ul做实验，其余保存于-80℃。

3.  300 ul中，100 ul加抗体做为实验组；100 ul不加抗体做为对照组；100 ul加入4 ul 5 M NaCl（NaCl终浓度为0.2 M），65℃处理3 h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。

4.  在100 ul的超声破碎产物中，加入900 ul ChIP DilutionBuffer和20 ul的50×PIC。

再各加入60 ul ProteinA Agarose/SalmonSpermDNA。4℃颠转混匀1 h。

5.  1 h后，在4℃静置10 min沉淀，700 rpm离心1 min。

6.  取上清。各留取20 ul做为input。一管中加入1 ul抗体，另一管中则不加抗体。4℃颠转过夜。

三、检验超声破碎的效果 （ *天）

1.  取100 ul超声破碎后产物，加入4 ul 5M NaCl，65℃处理2 h解交联。

2.  分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

四、免疫复合物的沉淀及清洗（ 第二天）

1.  孵育过夜后，每管中加入60 ul ProteinA  Agarose/SalmonSperm DNA。4℃颠转2 h。

2.  4℃静置10 min后，700 rpm离心1 min。除去上清。

3.  依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4℃颠转10 min，4℃静置10 min沉淀，700 rpm离心1 min，除去上清。

洗涤溶液：

（1）low salt wash buffer-one wash

（2）highsalt wash buffer-one wash

（3）LiCl wash buffer-one wash

（4）TE buffer-two wash

4.  清洗完毕后，开始洗脱。

洗脱液的配方：100 ul 10%SDS，100 ul1M NaHCO₃，800 ul ddH₂O，共1 ml。

每管加入250 ul洗脱buffer，室温下颠转15 min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。zui终的洗脱液为每管500 ul。

5.  解交联：每管中加入20 ul 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2 M）。

6.  混匀，65℃解交联过夜。

五、DNA样品的回收（第三天）

1.  解交联结束后，每管加入1 ul RNaseA（MBI），37℃孵育1 h。

2.  每管加入10 ul 0.5 M EDTA，20 ul1M Tris.HCl（PH6.5），2 ul 10 mg/ml蛋白酶K。45℃处理2 h。

3.  DNA片段的回收----omega胶回收试剂盒。zui终的样品溶于100 ul ddH₂O。

六、PCR分析（第三天）