从培养细胞中分离的细胞核制备成的提取物在体外转录和mRNA加工中具有的功能,可以用作纯化这些过程所涉及的蛋白质的起始材料。 提取物的蛋白含量一般为8~12。
实验材料 | 哺乳动物 |
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试剂、试剂盒 | PBS低渗缓冲液低盐缓冲液透析缓冲液 |
仪器、耗材 | 转子离心机电导计透析膜匀浆机离心管 |
实验步骤 | 1a. 收集转瓶培养的细胞:将浓度为5~10×108细胞/l 的培养液用1 L 的塑料瓶1 850 g 离心20 min,将细胞收入50 ml 锥形离心管中(每管收2~3 L 培养液中的细胞)。进行步骤2。
1b. 收集单层培养的细胞:单层细胞长满后去掉培养液。用PBS洗1次。将细胞刮入新鲜PBS液里,倒进锥形离心管中。进行步骤2。
3a. 转瓶培养细胞:测量压紧后细胞的体积。将细胞重悬于约5倍于其pcv的PBS液中,1 850 g 离心10 min。进行步骤4。
5. 在Dounce氏玻璃匀浆器中用B号研杵缓馒上下抽提10次以上。用台盼蓝染色排斥法在显微镜下检査细胞裂解滑况(应大于80%~90%)。
9. 25 000 g 离心30 min,测量核提取物的电导率(用上请,见步骤10)。
11. 将提取物从透析袋中移出45 000 g 离心20 min。
12. 用Bradford分析法测定上清中蛋白质的浓度。分装,浸入液氮中速冻,- 80℃保存。 |
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