发现tRNA衍生的小RNA在植物抗真菌防卫反应中的功能

转运RNA（tRNA）是一种由76-90个核苷酸（nt）组成的RNA分子，它的经典功能是在蛋白质翻译过程中负责将mRNA序列转译为氨基酸序列。tRNA具有三叶草形的二级结构，这种结构由氨基酸接受茎、D（二氢尿苷酸）茎环、反密码子茎环和TψC茎环（ψ代表假尿苷酸）组成。近年来的研究发现，在人和动植物中，tRNAs可被切割加工，产生多种小RNAs。当切割位于反密码子环时，产生5′和3′ tRNA半分子（tRNA halves）；当切割位于TψC环时，产生3′ tRNA衍生的小RNA（3′ tsRNA）；而当切割发生在D环、D茎或5′反密码子茎时，则产生5′ tRNA衍生的小RNA (5′ tsRNA)。

在植物中，5′ tRNA half和5′ tsRNA是丰度的两类tRNA衍生小RNAs，但其产生机制以及生物学功能尚不明确。清华大学生命科学学院戚益军课题组利用新开发的小RNA测序方法，系统分析了模式植物拟南芥中5′ tRNA halves和5′ tsRNAs，并发现5′ tsR-Ala通过调节靶基因CYP71A13的表达和植保素的合成，从而调控植物抗真菌防卫反应。

相关研究论文“一个5′ tRNA-Ala衍生的小RNA调控植物抗真菌防卫反应" （A 5′ tRNA-Ala-derived small RNA regulates anti-fungal defense in plants）在线发表在《中国科学》（SCIENCE CHINA Life Sciences）上。

在这项研究中，戚益军课题组首先针对tRNA衍生小RNAs的特征，开发了一种基于RtcB连接酶的小RNA文库构建及测序方法（RtcB sRNA-seq），该方法能够同时捕捉并定量区分末端为3′羟基和3′磷酸/环磷酸的小RNAs。利用RtcB sRNA-seq，系统鉴定分析了拟南芥幼苗中5′ tRNA halves和5′ tsRNAs，发现80个tRNAs可产生近千个5′ tRNA halves和5′ tsRNAs，其中tRNA-Ala、tRNA-Gly和tRNA-Glu衍生的5′ tRNA halves和5′ tsRNAs丰度。tRNA-Ala主要产生19-nt的 5′ tsR-Ala，tRNA-Gly主要产生18-nt的5′ tsR-Gly和35-nt 5′ tRNA-Gly half，而tRNA-Glu则主要产生15-nt的5′ tsR-Glu和35-nt 5′ tRNA-Glu half（图1）。

该研究进一步着重探索了5′ tsRNAs的产生机制及生物学功能。通过分析RNase T2家族RNA内切酶RNS1至RNS5突变体中5′ tsRNAs的积累，发现RNS1和RNS3负责产生包括5′ tsR-Ala在内的众多5′ tsRNAs。为了研究5′ tsRNAs的生物学功能，利用RNA测序方法分析了rns1和rns3突变体的基因表达谱，发现突变体中大量参与植物抗真菌的茉莉酸信号通路基因上调表达。灰霉菌接种实验表明，与野生型植物相比，rns1和rns3突变体更抗灰霉菌侵染（图2）。这些结果说明RNS1和RNS3可通过切割tRNAs产生5′ tsRNAs，负调控植物对灰霉菌的抗性。

该研究最后阐明了其中一个丰度的5′ tsRNA，19-nt 5′ tsR-Ala的功能。发现5′ tsR-Ala能够与AGO1结合，并切割与其序列互补的靶标CYP71A13 mRNA，从而负调控CYP71A13基因的表达。CYP71A13编码植保素（植物产生的一种抗菌分子）合成途径中的一个关键酶。利用短串联模拟靶标（STTM）技术沉默5′ tsR-Ala，发现在5′ tsR-Ala沉默的植物中， CYP71A13表达上升，植保素含量增加，对灰霉菌抗性增强。特别有意思的是，研究发现植物在受到灰霉菌侵染时，包括5′ tsR-Ala在内的众多5′ tsRNA积累水平下降。

根据上述结果，该研究提出了植物中5′ tsR-Ala调控植物抗真菌防卫反应的工作模型（图3）。在没有真菌侵染的情况下，植物通过RNS1和RNS3切割tRNA-Ala生成5′ tsR-Ala，5′ tsR-Ala与AGO1结合，切割CYP71A13 mRNA，从而抑制植保素合成和植物对真菌的防卫反应；而当真菌入侵时，植物通过下调5′ tsR-Ala的产生水平，增强CYP71A13的表达和植保素的合成，从而激活植物的防卫反应